[發明專利]一種在體內獲得并純化大量目的LncRNA的方法

有效

• 申請號: 201710040358.0
• 申請日: 2017-01-19
• 公開（公告）號: CN106591367B
• 公開（公告）日: 2019-05-07
• 發明（設計）人: 肖建如;周旺;李博;陳天睿;魏海峰;王靜;嚴望軍;李佳林
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第二軍醫大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/113
• 代理公司: 上海卓陽知識產權代理事務所(普通合伙) 31262
• 代理人: 周春洪

本發明涉及一種在體內獲得并純化大量目的LncRNA的方法。本發明在LncRNA基因序列3’末端設計PPR蛋白特異性識別堿基，將PPR蛋白和LncRNA過表達質粒共轉染細胞，使PPR和LncRNA在細胞內大量表達，然后通過Anti?Flag抗體富集PPR蛋白，進而間接富集LncRNA，實現了在體內成功獲得并純化大量目的LncRNA。本發明可明顯簡化現有技術中體外轉錄獲得目的LncRNA的步驟，且經濟簡便，可行性強，便于LncRNA相關實驗的研究，在LncRNA的作用機制研究領域提供了嶄新的思路。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地說，涉及一種在體內獲得并純化大量目的LncRNA的方法。

背景技術

目前，長鏈非編碼RNA(LncRNA)的研究十分廣泛。已證明LncRNA在腫瘤的發生發展中起到關鍵作用，并且具有組織特異性和時空特異性。在研究LncRNA的功能機制時，多數研究人員需要在體外獲得大量的LncRNA，然后通過體外實驗證明LncRNA和核酸以及蛋白之間的相互作用，從而研究其在細胞和組織中的功能特點。通過相應的DNA模板、RNA轉錄酶、NTP以及其他相應的反應條件，在體外大量獲得LncRNA的方法，稱為“體外轉錄法”。通過體外轉錄法獲得LncRNA的方法是目前主流的獲得LncRNA的方法，但是該方法有其缺陷：一、體外獲得的LncRNA對實驗條件研究嚴格：在體外通過轉錄獲得LncRNA，轉錄常常不完整，且由于體外難以做到徹底清除RNA酶，轉錄出的LncRNA如果長度較長，常常會邊轉錄邊降解，從而影響后續的實驗；二、體外轉錄的實驗成本較大：體外轉錄的相關試劑常常價格昂貴；三、體外轉錄后續實驗難度大：體外轉錄獲得的LncRNA，后續研究的實驗一般也在體外完成，如研究LncRNA和蛋白相關作用，需要將蛋白裂解后再與LncRNA相互作用，通過質譜檢測或者WB明確相互作用的蛋白，實驗的條件要求嚴格，費用高。四、由于在LncRNA體外轉錄相關的后續研究也在體外完成，獲得的LncRNA由于未在細胞中進行自然加工與合成，無法很好的還原真實的細胞內環境，往往會導致大量的假陽性結果。

綜上所述，亟需一種經濟簡便，可行性強的獲得并純化大量目的LncRNA的方法。

PPR(pentatricopeptide repeat)蛋白對單鏈RNA具有序列特異性識別模式，具體模式為：PPR蛋白由數目不等的重復單元串聯而成，每個經典PPR重復單元含有35個氨基酸，可以特異性地識別一個RNA堿基，并且第5位和第35位氨基酸在RNA特異識別過程中發揮著重要作用，被稱為密碼氨基酸。

目前關于應用PPR蛋白在體內高效富集目的LncRNA的方法還未見報道。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種在體內獲得大量目的LncRNA的方法。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案是：

一種在體內獲得并純化大量目的LncRNA的方法，包括以下步驟：

a)將帶有標簽蛋白的PPR蛋白的過表達載體與LncRNA過表達載體共轉染工具細胞，所述的LncRNA過表達載體的LncRNA基因序列下游帶有PPR蛋白的特異性識別堿基序列；

b)培養工具細胞；

c)裂解工具細胞，富集和純化PPR蛋白，進而間接地富集和純化得到LncRNA。

所述的PPR蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的PPR蛋白的基因序列如SEQ ID NO.3所示。

所述的PPR蛋白過表達載體的構建方法為：將PPR蛋白的基因序列插入到pcDNA3.1載體的HindIII和EcoRI位點之間，并于PPR蛋白的基因序列上游插入標簽蛋白的編碼序列。

所述的PPR蛋白的特異性識別堿基序列如SEQ ID NO.2所示。