[發(fā)明專利]一種在體內(nèi)獲得并純化大量目的LncRNA的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710040358.0
• 申請(qǐng)日: 2017-01-19
• 公開（公告）號(hào): CN106591367B
• 公開（公告）日: 2019-05-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 肖建如;周旺;李博;陳天睿;魏海峰;王靜;嚴(yán)望軍;李佳林
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N15/113
• 代理公司: 上海卓陽知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31262
• 代理人: 周春洪

1.一種在體內(nèi)獲得并純化目的LncRNA的方法，其特征在于，包括以下步驟：

a)將帶有標(biāo)簽蛋白的PPR蛋白的過表達(dá)載體與LncRNA過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染工具細(xì)胞，所述的LncRNA過表達(dá)載體的LncRNA基因序列下游帶有PPR蛋白的特異性識(shí)別堿基序列；

b)培養(yǎng)工具細(xì)胞；

c)裂解工具細(xì)胞，富集和純化PPR蛋白，進(jìn)而間接地富集和純化得到LncRNA。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的PPR蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的PPR蛋白的基因序列如SEQ ID NO.3所示。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的PPR蛋白過表達(dá)載體的構(gòu)建方法為：將PPR蛋白的基因序列插入到pcDNA3.1載體的HindIII和EcoRI位點(diǎn)之間，并于PPR蛋白的基因序列上游插入標(biāo)簽蛋白的編碼序列。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的PPR蛋白的特異性識(shí)別堿基序列如SEQ ID NO.2所示。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的LncRNA過表達(dá)載體選自下列中的一種：

a)pcDNA3.1-H19：將SEQ ID NO.4所示的H19的基因序列插入到pcDNA3.1載體的HindIII和EcoRI位點(diǎn)之間；

b)pcDNA3.1-HOTAIR：將SEQ ID NO.5所示的HOTAIR的基因序列插入到pcDNA3.1載體的HindIII和EcoRI位點(diǎn)之間；

c)pcDNA3.1-BANCR：將SEQ ID NO.6所示的BANCR的基因序列插入到pcDNA3.1載體的HindIII和EcoRI位點(diǎn)之間。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的工具細(xì)胞是HEK-293T細(xì)胞。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的標(biāo)簽蛋白是Flag標(biāo)簽。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，步驟c)是通過標(biāo)簽蛋白的抗體富集PPR蛋白。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟c)中的每個(gè)具體操作均使用RNA酶抑制劑。