[發明專利]一種用于阿膠真偽鑒定的組合物、試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請號: 201710039052.3
• 申請日: 2017-01-19
• 公開（公告）號: CN106872591B
• 公開（公告）日: 2019-12-03
• 發明（設計）人: 周祥山;郝向慧;郭尚偉;段小波;徐云鵬;王靜;王玉嬌;石永堅;張春輝
• 申請（專利權）人: 東阿阿膠股份有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 11139 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司
• 代理人: 孫皓晨;馬鑫<國際申請>=<國際公布>=

1.一種鑒定阿膠真偽的方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)對照品溶液的制備：

對照品檢測基質粉碎后，稱取一定量的對照品檢測基質于量瓶中，加入NH₄HCO₃溶液，超聲使樣品完全溶解，得到基質溶液，用配制得到的基質溶液溶解稱量好的多肽I、多肽II和多肽III，搖勻，得到對照品母液，采用分步稀釋的方法，以基質溶液為溶劑，將對照品母液稀釋500-10⁵倍，微孔濾膜過濾，續濾液中加胰蛋白酶溶液，酶解；

所述多肽I的氨基酸序列為Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Thr-Gly-Pro-Val-Gly-Lys，多肽II的氨基酸序列為His-Gly-His-Arg，多肽III的氨基酸序列為Gly-Val-Val-Gly-Pro-Gln-Gly-Ala-Arg，對照品檢測基質為魚皮膠；

2)待檢測樣品溶液的制備：

取待測純品膠樣品于量瓶中，加NH₄HCO₃溶液溶解，微孔濾膜過濾，續濾液加胰蛋白酶酶解；

3)將對照品溶液、待檢測樣品溶液分別放入液質聯用儀，選擇m/z469.5→457.3、655.4，m/z253.8→312.2，369.2，m/z421.0→684.4、528.3作為檢測離子對進行MRM掃描，其中選擇m/z469.5→457.3、m/z253.8→312.2、m/z421.0→684.4分別作為多肽I、多肽II和多肽III的定量離子對，待檢測阿膠樣品中多肽I的含量記為M₁、多肽II的含量記為M₂、多肽III的含量記為M₃；

4)按下式計算出阿膠樣品中阿膠的含量：

阿膠中驢皮源成分的含量％＝(M₁/937.1–M₂/505.5)×840/M₃×100％。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的NH₄HCO₃溶液為1％w/wpH8.0的NH₄HCO₃溶液。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的對照品溶液的制備包括以下步驟：

1)基質溶液的制備：對照品檢測基質粉碎后，稱取0.50g的對照品檢測基質于250ml量瓶中，加少量1％w/w pH8.0的NH₄HCO₃溶液，超聲使樣品完全溶解，用1％w/w pH8.0的NH₄HCO₃溶液稀釋至刻度，搖勻；

2)稱取0.05g對照品檢測基質于25ml量瓶中，加少量1％w/w pH8.0的NH₄HCO₃溶液，超聲使樣品完全溶解，分別加入18.3mg的多肽I、9.9mg的多肽II和16.4mg的多肽III，用1％w/wpH8.0的NH₄HCO₃溶液稀釋至刻度，搖勻；

3)對照品溶液的制備：采用分步稀釋的方法，以基質溶液為溶劑，分別將對照品母液稀釋500-10⁵倍，微孔濾膜過濾，精密量取續濾液100μl加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒溫酶解12h。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中所述的待檢測樣品溶液的制備包括以下步驟：取0.05g待測純品膠樣品于25ml量瓶中，加少量1％w/w pH8.0的NH₄HCO₃溶液，超聲使樣品完全溶解，用1％w/w pH8.0的NH₄HCO₃溶液稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，精密量取續濾液100μl加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒溫酶解12h。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中液質聯用儀檢測的液相條件為：C₁₈反相色譜柱，流動相A為含有0.1％v/v甲酸的水溶液，流動相B為含有0.1％v/v甲酸的乙腈溶液，流速0.3ml/min；梯度洗脫：0→20min，流動相A 100％→25％，流動相B 0％→75％；質譜條件：電噴霧正離子模式(ESI⁺)進行多反應監測。