[發(fā)明專利]用于鑒定六種褐腐病菌的實時熒光定量PCR檢測試劑盒及檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710038408.1
• 申請日: 2017-01-19
• 公開（公告）號: CN106755476B
• 公開（公告）日: 2020-04-21
• 發(fā)明（設計）人: 朱小瓊;國立耘;王靜茹
• 申請（專利權）人: 中國農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6851;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀凱知識產(chǎn)權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;白艷

本發(fā)明公開了一種用于鑒定六種褐腐病菌的實時熒光PCR檢測試劑盒及檢測方法。本發(fā)明提供的試劑盒，包括Mfc引物探針組合物、Mla引物探針組合物、Mmu引物探針組合物、Mfg引物探針組合物、Myu引物探針組合物和Mpo引物探針組合物。通過實驗證明：本發(fā)明的試劑盒可以快速準確的鑒定Monilinia fructicola、Monilinia laxa、Monilia mumecola、Monilinia fructigena、Monilia yunnanensis以及Monilia polystroma。本發(fā)明的試劑盒不僅能夠滿足病害防治及口岸檢疫部門對褐腐病菌快速、準確鑒定方法和技術的迫切需求，也為病害防治及檢驗檢疫提供技術支持和決策參考，具有重要的推廣應用價值。

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種用于鑒定核果和仁果上六種褐腐病菌的實時熒光PCR檢測試劑盒、檢測方法及其應用。

背景技術

褐腐病(Brown Rot)是桃、杏、櫻桃等核果及蘋果、梨等仁果上重要的病害。褐腐病可以危害多種核果仁果植物引起花腐、枝干潰瘍、果實腐爛等不同癥狀，其中危害最嚴重的是造成產(chǎn)中和產(chǎn)后的果實腐爛。2001年，美國南部的喬治亞州桃上褐腐病大面積發(fā)生，造成的直接經(jīng)濟損失達430萬美元，由于防治褐腐病購買殺菌劑帶來的間接經(jīng)濟損失為150萬美元(Phillips,2002)。根據(jù)對北京地區(qū)桃褐腐病的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，桃褐腐病的發(fā)病率為20％，嚴重時發(fā)病率達100％，嚴重影響果實的食用價值和果農(nóng)的經(jīng)濟收入(陳笑瑜等，2003)。其它地區(qū)也經(jīng)常報道褐腐病的發(fā)生和危害(林永安等，2004；孫寶海，2006；毛立仁等，2007)。

褐腐病的病原菌為鏈核盤菌屬(Monilinia)，分類上屬于子囊菌門(Ascomycete)，盤菌綱(Discomycete)，柔膜菌目(Helotiales)，核盤菌科(Sclerotiniaceae)；無性態(tài)屬于串珠霉屬(Monilia)。根據(jù)最新的研究進展，目前世界上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了6種褐腐病菌：Monilinia fructicola、Monilinia fructigena、Monilinia laxa、Monilia polystroma、Monilia mumecola以及Monilia yunnanensis。這些褐腐病菌在世界各地的分布不同，M.fructicola主要分布在北美和亞洲地區(qū)，仍然是歐州地區(qū)的重要檢疫對象。M.fructigena主要分布在歐州。M.laxa分布在歐洲、北美洲。在我國，發(fā)現(xiàn)了所有世界上已經(jīng)報道的種類，普遍存在M.yunnanensis，在一些地區(qū)發(fā)現(xiàn)了M.fructicola、M.polystroma，在局部地區(qū)也發(fā)現(xiàn)了M.mumecola。M.fructigena和M.laxa僅在新疆的野果林中檢測到。因此，一些種群屬于國際間或國內(nèi)地區(qū)間的檢疫對象。我國是桃、蘋果、梨等核果仁果重要的進出口國家，隨著各國果品貿(mào)易的不斷加強，急切需要加強對褐腐病菌的檢疫工作。

褐腐病菌的準確檢測和鑒定顯得尤為重要。幾種褐腐病菌的形態(tài)特征非常相似，缺少經(jīng)驗時很難準確判斷。近年發(fā)展起來的分子生物學技術也在褐腐病菌的種類鑒定中得到了廣泛應用(Ioos et al.,2000；Hughes,et al.2000；Ma et al.,2003；Cote et al.,2004；Gell et al.,2007)。但根據(jù)文獻報道以及本研究小組的測試，這些方法都不能用于準確鑒定6種褐腐病菌。在6種褐腐病菌中，M.mumecola與M.laxa最相近，M.yunnanensis與M.polystroma和M.fructigena最相近，在褐腐病菌的鑒定中難以區(qū)分。

Real-time PCR方法是近年發(fā)展起來可用于快速檢測病原菌的分子方法，目前在褐腐病菌的研究中已經(jīng)開發(fā)用于檢測Monilinia fructicola、M.laxa等。目前仍然缺少區(qū)分6種褐腐病菌的Real-time PCR檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術問題是如何鑒定或輔助鑒定褐腐病菌。