[發(fā)明專利]一種人結(jié)腸癌干細(xì)胞的制備方法及其應(yīng)用

有效

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• 申請日: 2017-01-19
• 公開（公告）號: CN108330148B
• 公開（公告）日: 2020-11-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬永;曹锫沛;陳晨
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇眾紅生物工程創(chuàng)藥研究院有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;G01N33/68;G01N33/569
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本發(fā)明涉及一種更有利于臨床前研究的人結(jié)腸癌干細(xì)胞的重編程方法及其應(yīng)用，主要是取人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480以表達(dá)Oct4，Sox2和Klf4三種轉(zhuǎn)錄因子的慢病毒感染細(xì)胞，并采用CD26作為結(jié)腸癌干細(xì)胞的分選標(biāo)志的方法，獲得了CD26及CD133雙細(xì)胞表位高豐度的結(jié)腸癌干細(xì)胞。本發(fā)明的重編程方法操作簡便且重編程效率高，得到的人結(jié)腸癌干細(xì)胞具有更強(qiáng)的耐藥性和體內(nèi)成瘤能力，符合腫瘤干細(xì)胞的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，可作為靶細(xì)胞用于抗腫瘤藥物體外藥效的篩選模型。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞領(lǐng)域，特別涉及由結(jié)腸癌細(xì)胞制備結(jié)腸癌干細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)

結(jié)腸癌作為最常見的惡性腫瘤之一，在全世界男性的腫瘤發(fā)病率中排名第3位，病死率中排名第4位，女性的腫瘤發(fā)病率中排名第2位，病死率中排名第3位。在過去的30多年里包括中國在內(nèi)的許多國家或地區(qū)結(jié)腸癌發(fā)病率呈上升的趨勢。結(jié)腸癌發(fā)病的主要原因是高脂肪食譜和纖維素?cái)z入不足，其治療方法是以手術(shù)為主、輔以化療、免疫治療、中藥以及其他支持治療的綜合方案。但是在臨床治療上，患者接受藥物后，起初反應(yīng)非常好，但幾個(gè)月后，腫瘤復(fù)發(fā)，并且對原先的治療藥物出現(xiàn)耐藥性。

隨著大量研究的深入，腫瘤干細(xì)胞的理論獲得越來越多研究結(jié)果的支持，結(jié)腸癌細(xì)胞中存在的結(jié)腸癌干細(xì)胞具有很高的自我更新能力，并具有外排化療藥物的特性，常規(guī)的化療藥物僅可殺死結(jié)腸癌細(xì)胞，而無法殺死結(jié)腸癌干細(xì)胞，從而導(dǎo)致癌癥無法根治且易復(fù)發(fā)。如何徹底的殺死結(jié)腸癌干細(xì)胞是治療結(jié)腸癌的關(guān)鍵，也是目前研究該疾病的主要趨勢。

腫瘤干細(xì)胞在臨床上有廣闊的應(yīng)用前景，如為腫瘤藥物提供篩選平臺。腫瘤干細(xì)胞會高表達(dá)一些特異性的表面分子，根據(jù)這些表面分子結(jié)合分選技術(shù)和富集可得到目的細(xì)胞。

CD133是最為普遍的用于篩選結(jié)腸癌干細(xì)胞的細(xì)胞表面分子,并且CD133的陽性表達(dá)可以用來判斷結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移和預(yù)后,所以CD133被認(rèn)為是一個(gè)理想的細(xì)胞表面分子。然而，Shmelkov(Shemelkov et al CD133 expression is not restricted to stem cells,and both CD133+and CD133–metastatic colon cancer cells initiate tumors.J ClinInvest.2008；118(6):2111-2120)等證明在轉(zhuǎn)移性的結(jié)腸癌中CD133陰性的細(xì)胞同樣能夠在動物模型中成瘤,說明僅以CD133作為轉(zhuǎn)移性的結(jié)腸癌細(xì)胞引發(fā)腫瘤生成的標(biāo)志性表面分子是不夠的，需要更具標(biāo)志性的表面分子同時(shí)作為結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞的判定依據(jù)。。A.L.Cavalieri等研究表明Lgr5也許是結(jié)腸癌干細(xì)胞的一個(gè)標(biāo)記，可望作為治療結(jié)腸癌的靶點(diǎn)并針對其開發(fā)相關(guān)藥物(Cavalieri,A.L.,et al.,Attosecond spectroscopy incondensed matter.Nature,2007.449(7165):p.1029-32)。除了此以外，可以用來篩選結(jié)腸癌干細(xì)胞的細(xì)胞表面分子還有CD166，CD44，CD29等。

目前有許多關(guān)于結(jié)腸癌干細(xì)胞表面標(biāo)志物的研究，研究顯示不同腫瘤之間，腫瘤干細(xì)胞表面分子不盡相同，并且在同一個(gè)腫瘤里也存在不同的腫瘤干細(xì)胞亞群。因此，如何找到一個(gè)結(jié)腸癌干細(xì)胞特異性的標(biāo)志物，進(jìn)而獲得更有利于臨床前研究的結(jié)腸癌干細(xì)胞，對靶向治療結(jié)腸癌提供理論依據(jù)具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供獲得有利于臨床前研究的人結(jié)腸癌干細(xì)胞的重編程方法，所述方法采用CD26作為結(jié)腸癌干細(xì)胞的分選標(biāo)志，以獲取CD26及CD133雙細(xì)胞表位的豐度均較高的結(jié)腸癌干細(xì)胞。

上述方法具體包括如下步驟：

步驟1、取人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480培養(yǎng)，再以表達(dá)Oct4，Sox2和Klf4三種轉(zhuǎn)錄因子的慢病毒感染細(xì)胞；

步驟2、以增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)；

步驟3、再以誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，待充分重編程后，傳代純化細(xì)胞；