[發(fā)明專利]一種黃曲霉毒素適配體親和柱及其制備方法和用途

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710037561.2
• 申請(qǐng)日: 2017-01-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106970172A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-07-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張彥明
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京美正生物科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N30/60
• 分類號(hào): G01N30/60;G01N30/06;G01N33/544
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種黃曲霉毒素的適配體親和柱及其制備方法和用途。該親和純化柱利用黃曲霉毒素B1的核酸適配體，修飾后通過(guò)共價(jià)鍵連接固相載體上。再用此載體填料裝柱，制備成適配體親和柱。該親和柱具有特異性強(qiáng)，黃曲霉毒素純化效率高和使用簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。

背景技術(shù)

黃曲霉毒素（aflatoxin ，AFT）主要是由黃曲霉和寄生曲霉等真菌產(chǎn)生的一類有毒次生代謝物。在世界不同地區(qū)都發(fā)現(xiàn)了這些真菌大量存在于供人類食用的食品中，黃曲霉毒素污染已導(dǎo)致嚴(yán)重的食品安全問(wèn)題。黃曲霉毒素是一類毒性極強(qiáng)的物質(zhì)，具有強(qiáng)致癌性和強(qiáng)免疫抑制性。1993年AFT被世界衛(wèi)生組織（WHO）的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為I類致癌物。黃曲霉毒素廣泛的分布于發(fā)霉的糧食及其制品中，特別是花生、花生油、玉米及其制品、乳及乳制品，發(fā)霉的飼料中也有發(fā)現(xiàn)含有較多的黃曲霉毒素。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的黃曲霉毒素至少包含黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2等17種結(jié)構(gòu)相似且特征已知的化合物。其中黃曲霉毒素B1是（AFTB1）是自然發(fā)生潛力最大、最為常見(jiàn)的一種毒素。是黃曲霉毒素中的主要成份。其毒性和致癌性也最強(qiáng)。

世界各國(guó)和地區(qū)均制定了嚴(yán)格的AFT限量標(biāo)準(zhǔn)，且限量要求日益嚴(yán)格。

目前黃曲霉毒素的檢測(cè)方法有薄層層析法、高效液相色譜法（HPLC）、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、放射免疫分析法、微柱法等。

其中薄層層析法是最早使用也是最廣泛使用的檢測(cè)黃曲霉毒素的方法，但是薄層層析法對(duì)樣品處理繁瑣，實(shí)驗(yàn)過(guò)程復(fù)雜，所需時(shí)間較多，容易受到雜質(zhì)的干擾。比較適合黃曲霉毒素的定性檢測(cè)。

放射免疫分析法由于使用到放射性元素，容易造成放射性污染，目前已經(jīng)很少人使用。酶聯(lián)免疫分析法操作簡(jiǎn)便，使用較為安全。但由于酶本身不穩(wěn)定，用此方法檢測(cè)有可能帶來(lái)一定的假陽(yáng)性和假陰性的問(wèn)題。微柱法主要用于快速篩選出超標(biāo)樣本，很難對(duì)毒素進(jìn)行種類區(qū)分和定量檢驗(yàn)。僅僅適用于定性檢測(cè)。

高效液相色譜法在操作上較為簡(jiǎn)便，可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)黃曲霉毒素種類，適于大批量的樣品分析。但是高效液相色譜檢測(cè)收到前期樣本處理的限制，只有前期將樣本進(jìn)行純化才能得到更好的檢測(cè)結(jié)果。而免疫親和純化柱很好的解決了這一問(wèn)題。利用免疫親和純化柱和高效液相色譜聯(lián)用能快速、準(zhǔn)確的得到結(jié)果，并且靈敏度很高。目前已經(jīng)被國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T18979-2003采用。

免疫親和柱具有操作簡(jiǎn)單，特異性高的優(yōu)點(diǎn)。但是由于抗體獲得困難，免疫親和柱通常比較昂貴。并且由于抗體本身是一種蛋白質(zhì)，其活性受到周圍環(huán)境的影響。保存不當(dāng)或者操作不當(dāng)很容易造成抗體失活從而影響免疫親和柱的效率。

適配體是一段核酸序列，通常為DNA或者RNA序列。 單鏈的核酸序列可以形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而能與靶點(diǎn)特異性結(jié)合。通過(guò)多次的富集和篩選，能夠篩選到與靶點(diǎn)有高親和力的特異性適配體。Herman等描述了核酸適配體的結(jié)合特異性，[Science 287,820-825].核酸適配體相對(duì)于抗體來(lái)說(shuō)更穩(wěn)定，不易受到環(huán)境的影響，并且核酸適配體可以化學(xué)合成，保證序列的準(zhǔn)確性。[Song. Trends Analy. Chem 2008.27(2)]。

核酸適配體被應(yīng)用于小分子的檢測(cè)，在專利CN105505940A中，描述了一種黃曲霉毒素B1的適配體DNA傳感器。通過(guò)黃曲霉毒素B1的適配體，及多條互補(bǔ)探針序列制備DNA傳感器，通過(guò)酶底物反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)黃曲霉毒素B1的檢測(cè)。在專利CN105400790A中，描述了一種黃曲霉毒素的檢測(cè)方法。利用黃曲霉毒素B1的適配體與蔗糖酶結(jié)合，通過(guò)酶與糖底物的相互作用，依靠血糖儀實(shí)現(xiàn)黃曲霉毒素B1的檢測(cè)。上述都是利用黃曲霉毒素適配體實(shí)現(xiàn)毒素的檢測(cè)。

在毒素分離中，專利CN 104651369A中描述了一種黃曲霉毒素磁性分離方法，將黃曲霉毒素B1核酸適配體序列與磁珠結(jié)合，實(shí)現(xiàn)分離。在專利CN104399283中，描述了一種黃曲霉毒素B1的適配體親和柱。該專利利用環(huán)氧基活化的瓊脂糖微球，將黃曲霉毒素B1的適配體偶聯(lián)，制備成親和柱。實(shí)現(xiàn)黃曲霉毒素的分離。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種黃曲霉毒素適配體親和柱及其制備方法和用途

在本發(fā)明中，我們利用SELEX系統(tǒng)，從適配體文庫(kù)中篩選出來(lái)一條高特異性、高親和力的的新的黃曲霉毒素B1的DNA適配體。適配體修飾后與N-羥基琥珀酰亞胺活化的載體通過(guò)共價(jià)鍵進(jìn)行偶聯(lián)。經(jīng)過(guò)洗滌和封閉得到黃曲霉毒素B1的特異性載體。載體裝柱后就形成了高親和力的黃曲霉毒素毒素B1適配體親和柱