[發(fā)明專利]一種提高米曲霉發(fā)酵淀粉合成L-蘋果酸的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710036762.0
• 申請(qǐng)日: 2017-01-18
• 公開（公告）號(hào): CN106591158B
• 公開（公告）日: 2019-06-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉龍;陳堅(jiān);劉晶晶;向玉;堵國(guó)成;李江華;房峻
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/15
• 分類號(hào): C12N1/15;C12P7/42;C12P7/46;C12R1/69
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 彭素琴

本發(fā)明公開了一種提高米曲霉發(fā)酵淀粉合成L?蘋果酸的方法，屬于基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明在基因工程菌A.oryzae PN5的基礎(chǔ)上，同時(shí)過表達(dá)葡萄糖苷酶編碼基因agdA和淀粉酶編碼基因amyB，所得重組菌A.oryzae GAA經(jīng)96h搖瓶發(fā)酵，可將100g/L的淀粉轉(zhuǎn)化成72g/L L?蘋果酸，6.4g/L琥珀酸和0.18g/L富馬酸，蘋果酸相對(duì)于淀粉的轉(zhuǎn)化率(g/g)為0.72，生產(chǎn)強(qiáng)度為0.75，為進(jìn)一步代謝改造米曲霉發(fā)酵淀粉生產(chǎn)L?蘋果酸奠定了基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種提高米曲霉發(fā)酵淀粉合成L-蘋果酸的方法，屬于基因工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)

蘋果酸作為一種重要的四碳二羧酸主要用作食品、飲料中的酸味劑，金屬物的清洗劑，以及農(nóng)業(yè)、化妝品和醫(yī)藥等領(lǐng)域。2004年，美國(guó)能源部將蘋果酸和富馬酸、琥珀酸這三種四碳二羧酸均作為可通過微生物利用可再生原料發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)的12種平臺(tái)化合物之一。

目前發(fā)酵法生產(chǎn)蘋果酸主要是通過細(xì)菌或絲狀真菌發(fā)酵葡萄糖，或高密度培養(yǎng)Ustilago trichophora發(fā)酵甘油等。細(xì)菌在糖代謝過程中，會(huì)產(chǎn)生乙酸、乳酸等副產(chǎn)物；絲狀真菌的糖代謝則伴隨著較高的檸檬酸、琥珀酸和富馬酸等的產(chǎn)生。甘油發(fā)酵產(chǎn)酸需要較高濃度的菌體和較長(zhǎng)的發(fā)酵周期，不利于工業(yè)化生產(chǎn)，而以葡萄糖作為發(fā)酵原料，與工業(yè)淀粉相比，成本高出1.2～1.5倍。

淀粉質(zhì)原料來源廣，價(jià)格低廉，是工業(yè)生產(chǎn)中理想的碳源。眾所周知，米曲霉作為“generally regarded as safe”(GRAS)菌株，早在1000多年前已被應(yīng)用于食品、飼料、產(chǎn)酸、釀酒等發(fā)酵工業(yè)，具有極強(qiáng)的淀粉酶分泌能力。基于現(xiàn)有技術(shù)關(guān)于發(fā)酵淀粉生產(chǎn)蘋果酸的研究，米曲霉發(fā)酵淀粉生產(chǎn)蘋果酸已變得可能，但仍存在很大的提升空間。由于可溶性淀粉溶于熱水后成糊狀，極低的流動(dòng)性會(huì)影響傳質(zhì)和菌體生長(zhǎng)，因此，提高菌體對(duì)淀粉的利用能力對(duì)于提高蘋果酸的發(fā)酵水平有重要作用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種基因工程菌，是以米曲霉為宿主，共表達(dá)編碼淀粉酶的基因amyB和編碼葡萄糖苷酶的基因agdA

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述基因amyB是NCBI Gene ID為5996200的基因，所述基因agdA是NCBI Gene ID為5992274的基因。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述基因工程菌以pBg32為載體，所述pBg32已于申請(qǐng)?zhí)枮?01610603538.0的發(fā)明專利中公開，該質(zhì)粒以pMD19為出發(fā)質(zhì)粒，通過連接米曲霉磷酸甘油酸激酶啟動(dòng)子(Ppgk)、構(gòu)巢曲霉的苯菌靈抗性基因(e)和葡萄糖淀粉酶終止子(Tgla)構(gòu)建而成。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，以淀粉誘導(dǎo)型強(qiáng)啟動(dòng)子PamyB表達(dá)基因amyB，以PagdA表達(dá)基因agdA；所述PamyB序列如SEQ ID NO.1所示；所述PagdA序列如SEQ ID NO.2所示。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述基因工程菌是以過表達(dá)了葡萄糖淀粉酶基因glaA的工程菌A.oryzae PN5為宿主；所述A.oryzae PN5是以質(zhì)粒pMD19為載體，以SEQ IDNO.7所示的淀粉誘導(dǎo)型的強(qiáng)啟動(dòng)子介導(dǎo)的，過表達(dá)NCBI Gene ID為5999830的glaA基因的重組米曲霉。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供所述基因工程菌的構(gòu)建方法，所述方法是將Gene ID為5996200的基因amyB、Gene ID為5992274的基因agdA與載體連接，轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞中。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種以淀粉為底物生產(chǎn)L-蘋果酸的方法，所述方法是將所述基因工程菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，28～30℃，200～250rpm發(fā)酵48～96h。