[發明專利]探針法qPCR檢測熊膽膠囊中熊源性成分的檢測方法

在審

• 申請號: 201710036492.3
• 申請日: 2017-01-18
• 公開（公告）號: CN107058495A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發明（設計）人: 白素英;張宇;王震;金煜
• 申請（專利權）人: 東北林業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種基于MGB探針的qPCR檢測熊膽膠囊中熊源性成分的檢測方法，涉及分子生物學領域。本發明檢測方法特異性好、靈敏度高、重復性好。

背景技術

亞洲傳統醫學認為，熊膽汁有清熱解毒、平肝明目、殺蟲止血的功效。黑熊膽和棕熊膽是制作熊膽膠囊制品的主要原材料。在巨大的經濟利益刺激下，許多不法商販用其他動物源性的膽來冒充熊膽。所以，迫切需要一種高效準確的檢測方法。

傳統的熊膽膠囊制品分子檢測手段，首先提取熊膽膠囊制品中的DNA，再利用引物擴增目的片段，最后通過測序比對的方法來鑒定熊膽膠囊的真偽。但是由于熊膽膠囊制品中DNA降解和片段化較為嚴重，很難擴增出能夠滿足測序分析的長序列，同時當待測樣品為摻假樣品時，也很難有效的鑒定。

實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質檢測每次聚合酶鏈式反應(PCR)循環后產物總量的方法。通過內參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定性定量分析的方法。該方法通過熒光信號的分析，對PCR進程進行實時檢測。探針法是qPCR中的一種常見方法，在反應體系中加入化學修飾的寡聚核苷酸探針。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收，無法檢測到熒光信號。而當PCR擴增時，Taq DNA酶的5’-3’端外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，熒光報告基團和淬滅基團間的能量傳遞結構被破壞，從而熒光檢測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物的形成完全同步。MGB探針是在傳統Taqman水解探針基礎上的改進，通過在探針的3’端加入MGB基團，從而提高探針的退火溫度，縮短探針的長度，提高探針的特異性和靈敏度。

本發明建立了一種對于熊膽膠囊制品的實時熒光定量PCR檢測方法，利用MGB探針，能夠高效、準確和更快速的檢測熊膽膠囊制品中是否含有黑熊和棕熊源性的成分，還可以對熊膽膠囊制品DNA提取液中的熊源性成分進行定量分析。同時能對常用于在熊膽膠囊中摻假的牛、豬源性成分進行分析鑒定。COI基因是目前國內外廣泛認可的DNA條碼，本發明針對COI基因設計引物和MGB探針。

發明內容

本發明的第一個目的是設計針對黑熊、棕熊以及常見摻偽物牛和豬的引物和探針。

本發明的第二個目的是為了克服現有分子生物學檢測技術的不足之處，建立一種使用方便、快捷、準確的熊膽膠囊中熊源性成分的檢測方法。

本發明的第三個目的是利用以上的引物探針和構建的檢測方法，對熊膽膠囊制品進行定性定量檢測。

為了達到上述目的，本發明采用以下方案：

1、DNA的提取體系

樣品的DNA提取參照AXYGEN動物基因組提取試劑盒說明書進行，取半個熊膽膠囊內容物、20mg棕熊、黑熊、豬和牛等肌肉組織，放置于2ml離心管中，加入350μl PBS和0.9μl RNase A，用剪刀溫和的剪碎組織30s。加入150μl裂解液和20μl蛋白酶K，立即渦旋振蕩1min混合均勻。短暫離心后，將離心管至于56℃水浴中過夜消化處理。加入350μl蛋白去除液，渦旋振蕩30s均勻混合，12000r/min離心10min。將DNA制備管至于2ml離心管中，將離心后的混合液上清移至制備管中，12000r/min離心1min。棄掉濾液，加入500μl洗滌液，12000r/min離心1min。棄掉濾液，加入700μl去鹽液，12000r/min離心1min。棄濾液，重復一次去鹽過程。棄濾液后，空管離心一分鐘。將DNA制備管轉移到新的1.5ml離心管中，加入65℃預熱的Tris-HCl洗脫液100μl洗脫制備管中DNA，-20℃冷凍備用。

2、引物和探針的設計

選取Genbank上已發表的黑熊(EF667005)、棕熊(AP012593)、牛(KU891849)和豬(KT279758)的線粒體COI序列，利用Blast進行比對后，選擇物種特異的DNA序列，利用ABI primer express 3.0設計引物與MGB探針，Primer 6.0分析引物二級結構，將所設計的引物和探針利用Blast再次進行比對分析，確保引物與探針的特異性。

引物探針設計結果：

3、本發明中單重qPCR檢測方法的建立