[發明專利]探針法qPCR檢測熊膽膠囊中熊源性成分的檢測方法

在審

• 申請號: 201710036492.3
• 申請日: 2017-01-18
• 公開（公告）號: CN107058495A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發明（設計）人: 白素英;張宇;王震;金煜
• 申請（專利權）人: 東北林業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種利用MGB探針法qPCR檢測熊膽膠囊制品中熊源性成分的方法，其特征在于包括特異性引物和探針的序列如下：

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2.根據權利1所述的利用MGB探針法qPCR檢測熊膽膠囊制品中熊源性成分的方法，其特征在于構建20μl單重熒光反應體系由以下組分組成：

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3.根據權利1和權利2所述的利用MGB探針法qPCR檢測熊膽膠囊制品中熊源性成分的方法，其特征在于構建20μl雙重熒光反應體系由以下組分組成：

。

4.一種采用如權利1、權利2和權利3所述的利用MGB探針法qPCR檢測熊膽膠囊制品中熊源性成分的方法，其特征在于包括以下步驟：

A、提取樣品DNA

B、對步驟A中的樣品DNA進行2次qPCR擴增，其中反應體系由以下組分組成：

所述的引物和探針：

C、利用普通PCR對每個模板分別進行擴增和瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目標條帶，微量紫外分光光度計測量濃度并進行10倍倍比稀釋，獲得5個濃度點。每個濃度點設置3個重復樣品，繪制標準曲線計算未知樣品濃度。

所述的引物：

所述的反應體系：

D、對擴增后的曲線情況進行結果判定，按照以下判定原則：

Ct值小于等于30并有明顯擴增曲線判為陽性；Ct值大于等于35判為陰性；Ct值介于30～35之間判為可疑，DNA模板加倍重復實驗，如果Ct值小于等于30并擁有明顯擴增曲線判為陽性，否則判為陰性。E、將膠回收產物按照10倍的比例倍比稀釋，共設置5個濃度點，每個濃度點設置3個重復樣。qPCR后繪制標準曲線，并利用標準曲線計算未知樣品的濃度。

5.根據權利4所述的檢測方法，其特征在于步驟B和步驟C所述的qPCR擴增按照以下步驟進行：

94℃2min；94℃10s，60℃30s 40個循環；60℃1min，循環在退火時收集熒光信號。

6.根據權利4所述的檢測方法，其特征在于步驟A所述的樣品DNA提取按照以下步驟進行：

取半個熊膽膠囊內容物放置于2ml離心管中，加入350μl PBS和0.9μl RNase A。加入150μl裂解液和20μl蛋白酶K，立即渦旋振蕩1min混合均勻。短暫離心后，將離心管至于56℃水浴中過夜消化處理。加入350μl蛋白去除液，渦旋振蕩30s均勻混合，12000r/min離心10min。將DNA制備管至于2ml離心管中，將離心后的混合液上清移至制備管中，12000r/min離心1min。棄掉濾液，加入500μl洗滌液，12000r/min離心1min。棄掉濾液，加入700μl去鹽液，12000r/min離心1min。棄濾液，重復一次去鹽過程。棄濾液后，空管離心一分鐘。將DNA制備管轉移到新的1.5ml離心管中，加入65℃預熱的Tris-HCl洗脫液100μl洗脫制備管中DNA，-20℃冷凍備用。