[發(fā)明專(zhuān)利]一種高效重組表達(dá)限制性?xún)?nèi)切酶的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710035737.0
• 申請(qǐng)日: 2017-01-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107058260A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-08-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高嵩;張坤曉;許恒皓;李肖;胡艷紅;張穎;吳勝月
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 淮海工學(xué)院
• 主分類(lèi)號(hào): C12N9/22
• 分類(lèi)號(hào): C12N9/22;C12N15/70
• 代理公司: 連云港潤(rùn)知專(zhuān)利代理事務(wù)所32255
• 代理人: 劉喜蓮

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，特別是一種高效重組表達(dá)限制性?xún)?nèi)切酶的方法。

背景技術(shù)

限制性?xún)?nèi)切酶是當(dāng)代基因工程研究不可缺少的一類(lèi)重要工具酶，是現(xiàn)代分子生物學(xué)的基礎(chǔ)。自20世紀(jì)60年代末第一個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶被發(fā)現(xiàn)之后，越來(lái)越多的限制性?xún)?nèi)切酶被發(fā)現(xiàn)、提純并獲得應(yīng)用。

現(xiàn)有技術(shù)中生產(chǎn)限制性?xún)?nèi)切酶的方法主要是將限制-修飾基因克隆入質(zhì)粒，使用與限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)應(yīng)的特異性甲基化酶制備限制性?xún)?nèi)切酶，靠質(zhì)粒的高拷貝數(shù)實(shí)現(xiàn)目的蛋白高表達(dá)，這種方法的制備程序繁瑣、限制性?xún)?nèi)切酶得率低、生產(chǎn)成本高，獲得的甲基化保護(hù)的菌株只能特異性保護(hù)宿主DNA免于某一種限制性?xún)?nèi)切酶的切割，應(yīng)用范圍狹窄。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出了一種操作簡(jiǎn)便、成本低、酶活力好的高效重組表達(dá)限制性?xún)?nèi)切酶的方法。

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的，一種高效重組表達(dá)限制性?xún)?nèi)切酶的方法，其特點(diǎn)是，包括如下步驟：

（1）先將限制性?xún)?nèi)切酶基因插入，再將載體轉(zhuǎn)化導(dǎo)入大腸桿菌，篩選培養(yǎng)、測(cè)序，獲得限制性?xún)?nèi)切酶的重組表達(dá)質(zhì)粒；

所述質(zhì)粒載體為利用乳糖操縱子和T7啟動(dòng)子調(diào)控，IPTG誘導(dǎo)的pET系列表達(dá)載體；

（2）將限制性?xún)?nèi)切酶的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）pLysS感受態(tài)細(xì)胞中，篩選獲得限制性?xún)?nèi)切酶的重組表達(dá)菌株；

（3）擴(kuò)大培養(yǎng)限制性?xún)?nèi)切酶的重組表達(dá)菌株并誘導(dǎo)表達(dá)限制性?xún)?nèi)切酶。

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題還可以通過(guò)以下的技術(shù)方案來(lái)進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)。以上所述的方法中，所述的限制性?xún)?nèi)切酶選自：BclI，DpnI，DpnII，EcoRI，HindIII，KpnI，MluI，MseI，NcoI，NdeI，NheI，NotI，NsiI，NspV，PstI，SalI， SbfI，SgeI，SspI，StuI，TaqI，XbaI，XhoI。

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題還可以通過(guò)以下的技術(shù)方案來(lái)進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)。以上所述的方法的步驟（1）中，所述的質(zhì)粒載體為pET-28b。

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題還可以通過(guò)以下的技術(shù)方案來(lái)進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)。以上所述的方法的步驟（1）中，將限制性?xún)?nèi)切酶基因片段連接至質(zhì)粒載體上后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，再涂布于含葡萄糖和卡那霉素的LB平板上篩選克隆，測(cè)序獲得限制性?xún)?nèi)切酶的重組表達(dá)質(zhì)粒。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的葡萄糖的濃度為0.5-2g/100mL，卡那霉素的濃度為37.5-150μg/mL。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的葡萄糖的濃度為1-1.5g/100mL，卡那霉素的濃度為50-120μg/mL。

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題還可以通過(guò)以下的技術(shù)方案來(lái)進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)。以上所述的方法的步驟（2）中，將限制性?xún)?nèi)切酶的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）pLysS感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含葡萄糖、卡那霉素和氯霉素的LB平板上篩選培養(yǎng)，獲得限制性?xún)?nèi)切酶的重組表達(dá)菌株。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的葡萄糖的濃度為0.5-2g/100mL，卡那霉素的濃度為37.5-150μg/mL，氯霉素的濃度為17.5-70μg/mL。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的葡萄糖的濃度為1-1.5g/100mL，卡那霉素的濃度為50-120μg/mL，氯霉素的濃度為20-50μg/mL。

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題還可以通過(guò)以下的技術(shù)方案來(lái)進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)。以上所述的方法的步驟（3）中，將限制性?xún)?nèi)切酶的重組表達(dá)菌株劃線培養(yǎng)并挑取單菌落接種于含葡萄糖、卡那霉素和氯霉素的LB培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，將得到的培養(yǎng)物接種于葡萄糖、卡那霉素和氯霉素的LB培養(yǎng)液中，搖動(dòng)培養(yǎng)一段時(shí)間，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)限制性?xún)?nèi)切酶。