[發明專利]一種高效重組表達限制性內切酶的方法

在審

• 申請號: 201710035737.0
• 申請日: 2017-01-17
• 公開（公告）號: CN107058260A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發明（設計）人: 高嵩;張坤曉;許恒皓;李肖;胡艷紅;張穎;吳勝月
• 申請（專利權）人: 淮海工學院
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22;C12N15/70
• 代理公司: 連云港潤知專利代理事務所32255
• 代理人: 劉喜蓮

1.一種高效重組表達限制性內切酶的方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）先將限制性內切酶基因插入，再將載體轉化導入大腸桿菌，篩選培養、測序，獲得限制性內切酶的重組表達質粒；

所述質粒載體為利用乳糖操縱子和T7啟動子調控，IPTG誘導的pET系列表達載體；

（2）將限制性內切酶的重組表達質粒轉化至BL21（DE3）pLysS感受態細胞中，篩選獲得限制性內切酶的重組表達菌株；

（3）擴大培養限制性內切酶的重組表達菌株并誘導表達限制性內切酶。

2.根據權利要求1所述的高效重組表達限制性內切酶的方法，其特征在于，所述的限制性內切酶選自：BclI，DpnI，DpnII，EcoRI，HindIII，KpnI，MluI，MseI，NcoI，NdeI，NheI，NotI，NsiI，NspV，PstI，SalI， SbfI，SgeI，SspI，StuI，TaqI，XbaI，XhoI。

3.根據權利要求1所述的高效重組表達限制性內切酶的方法，其特征在于，在步驟（1）中，所述的質粒載體為pET-28b。

4.根據權利要求1所述的高效重組表達限制性內切酶的方法，其特征在于，在步驟（1）中，將限制性內切酶基因片段連接至質粒載體上后，將連接產物轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞中，再涂布于含葡萄糖和卡那霉素的LB平板上篩選克隆，測序獲得限制性內切酶的重組表達質粒。

5.根據權利要求4所述的高效重組表達限制性內切酶的方法，其特征在于，所述的葡萄糖的濃度為0.5-2g/100mL，卡那霉素的濃度為37.5-150μg/mL。

6.根據權利要求1所述的高效重組表達限制性內切酶的方法，其特征在于，在步驟（2）中，將限制性內切酶的重組表達質粒轉化至BL21（DE3）pLysS感受態細胞中，涂布于含葡萄糖、卡那霉素和氯霉素的LB平板上篩選培養，獲得限制性內切酶的重組表達菌株。

7.根據權利要求6所述的高效重組表達限制性內切酶的方法，其特征在于，所述的葡萄糖的濃度為0.5-2g/100mL，卡那霉素的濃度為37.5-150μg/mL，氯霉素的濃度為17.5-70μg/mL。

8.根據權利要求1所述的高效重組表達限制性內切酶的方法，其特征在于，在步驟（3）中，將限制性內切酶的重組表達菌株劃線培養并挑取單菌落接種于含葡萄糖、卡那霉素和氯霉素的LB培養液中，振蕩培養過夜，將得到的培養物接種于葡萄糖、卡那霉素和氯霉素的LB培養液中，搖動培養一段時間，加入IPTG誘導表達限制性內切酶。

9.根據權利要求8所述的高效重組表達限制性內切酶的方法，其特征在于，在步驟（3）中，將限制性內切酶的重組表達菌株劃線培養并挑取單菌落接種于含0.5-2g/100mL葡萄糖、37.5-150 μg/mL卡那霉素和17.5-70 μg/mL氯霉素的LB培養液中，振蕩培養過夜，將得到的培養物按接種量2-5%接種于含0.5-2g/100mL葡萄糖、37.5-150 μg/mL卡那霉素和17.5-70 μg/mL氯霉素的LB培養液中，于35-37℃搖動培養，至菌密度達到3×10⁸-4×10⁸/mL時，加入IPTG至終濃度為0.2-0.5mM，并在15-18℃下以200-250 rpm搖動培養12-18 h，誘導表達限制性內切酶。