[發明專利]一種培養cPGCs的完全培養基以及其使用方法

在審

• 申請號: 201710035052.6
• 申請日: 2017-01-18
• 公開（公告）號: CN106635965A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發明（設計）人: 陳志勝;趙姝燦;張曉芳;李東升
• 申請（專利權）人: 佛山科學技術學院
• 主分類號: C12N5/0735
• 分類號: C12N5/0735
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司44100
• 代理人: 許英偉

技術領域

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及一種培養cPGCs的完全培養基以及其使用方法。

背景技術

原始生殖細胞細胞(Primordial Germ Cells,PGCs)是配子的前體并且是繁殖的中心。生殖細胞譜系的精確自我更新是生育和繁殖成功的基礎。在禽類物種中，PGCs在胚胎發生期間比在哺乳動物中更早形成,在雌性中它最終發育為卵細胞,在雄性中最終發育為精子。在胚胎中的遷移途徑—通過血液循環后移植入性腺,使它能成為冷凍保種的目標細胞,同時成為轉基因禽類制備中的良好載體。由于PGCs能夠發育成為有功能的配子,它作為載體攜帶外源基因,制造性腺嵌合體乃至制備轉基因動物,具有較高的研究價值。

目前在雞原始生殖細胞(Chicken Primordial Germ Cells，cPGCs)的培養中大量采用有血清、飼養層培養體系培養，而這種培養體系存在一定的缺陷，如何獲得一種更方便、無不明確物質成分的體外培養方法顯然成為cPGCs培養的關鍵。血清是一種成分極其復雜的外源物質，在實驗和應用中無法確定是血清中何種組分影響了細胞行為。飼養層細胞是指一些特定細胞經有絲分裂阻斷劑處理后得到的細胞單層。目前所采用的飼養層主要有STO細胞株、雞胚胎原代成纖維細胞(PCEF)、性腺基質細胞(SCs)、小鼠胚胎原代成纖維細胞(PMEF)等，均能不同程度促進細胞增殖和分泌白血病抑制因子(LIF)以及產生其他分泌物以抑制其分化。由于這些分泌物質成分尚不清楚，在研究細胞分化的分子機制方面產生一定的干擾；在基因修飾的研究中，需要通過藥物篩選獲得穩定表達目的基因的cPGCs，通常采用含有抗性基因的飼養層來進行培養篩選，而這種有飼養層體系的培養將實驗復雜化，增加了實驗的操作難度，且藥物篩選后對飼養層造成的破壞也會影響細胞生長；另一方面，這些細胞需要絲裂霉素處理阻斷其有絲分裂后用作飼養層細胞，即使是極其微量的絲裂霉素殘留也會對cPGCs細胞的生長造成影響；非禽類的異源細胞用作飼養層飼養時，也會對cPGCs細胞產生一定的影響；動物源性的血清和飼養層細胞的污染物會污染細胞自身的應用。此外，飼養層的使用以及血清的添加也一定程度的延長了實驗的時間，增加了實驗經費的投入。

因此，建立cPGCs無血清、無飼養層培養體系可以為以后在胚胎發育基礎研究、轉基因禽類生產、藥物篩選、家禽育種等方面提供巨大貢獻。

發明內容

本發明克服了現有技術中的缺點，提供了一種培養cPGCs的完全培養基以及其使用方法，其具有成分明確、方便操作、減少污染、降低成本、避免細胞受損等優勢，應用前景廣闊。

為了解決上述技術問題，本發明是通過以下技術方案實現的：

一種培養cPGCs的完全培養基，包括KO-DMEM、B-27supplement、NAA、nucleosides、GlutaMAX II、β-巰基乙醇、卵清蛋白、OVT、肝素鈉、Activin A、TGF-β1、BMP4、FGF-2、IGF-1。

進一步，以KO-DMEM為基礎培養基，并添加20-30ng/ml的BMP4、20-30ng/ml的TGF-β1、20-30ng/ml的Activin A、5-20ng/ml的OVT、1-5ng/ml的FGF-2。

進一步，以KO-DMEM為基礎培養基，還包括其1-2％的50X B-27supplement、1％的100X NAA、1％的100X nucleosides、2.0mM GlutaMAX II、0.1mMβ-巰基乙醇、1-2％卵清蛋白、0.5％-2％肝素鈉，均為體積比。

進一步，還含有以KO-DMEM為基礎培養基，體積比0.5％-2％的三抗，所述三抗由青霉素、鏈霉素、兩性霉素B組成。

一種培養cPGCs的完全培養基的使用方法，包括以下步驟：

(1)采集的14HH雞胚血液置入含有cPGCs完全培養液的培養體系中培養，原代培養10-15d即可純化細胞；

(2)將純化后cPGCs細胞重新置入cPGCs完全培養基進行體外培養擴增；

(3)對體外培養擴增的cPGCs進行計數、間接免疫熒光檢測，包括SSEA-1和DAZL表面標記。

與現有技術相比，本發明的有益效果是：

(1)本發明打破了有血清、有飼養層的傳統培養方法，培養基的成分明確，便于研究細胞分化的分子機制。

(2)本發明避免了異源細胞作為飼養層后產生的不利影響。

(3)本發明避免了制備飼養層時一些藥物殘留，降低了對細胞的不良影響。