[發明專利]一種體外擴增CD8+T細胞及其細胞亞群的方法

有效

• 申請號: 201710034922.8
• 申請日: 2017-01-17
• 公開（公告）號: CN106834228B
• 公開（公告）日: 2021-03-23
• 發明（設計）人: 徐建青;張曉燕;邱趁麗
• 申請（專利權）人: 上海新長安生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 北京德崇智捷知識產權代理有限公司 11467
• 代理人: 衛麟

本發明建立了一種體外快速擴增CD8+T細胞及其功能性細胞亞群的方法。在常規培養擴增CD8+T細胞的體外培養體系中，增加TLR1/2激動劑、TLR2/6激動劑、TLR5激動劑或聯合使用上述激動劑可顯著提升CD8+T細胞的擴增效率；此外，TLR激動劑的使用可以使常規培養條件下難以擴增的功能性CD8+T細胞亞群得以擴增，如PD?1+CD8+T細胞、T_EM CD8+T細胞等；CD8+T細胞及其功能性細胞亞群在TLRs激動劑和重組細胞因子IL?2、IL?7、IL?15以及抗人CD3抗體和抗人CD28抗體包被的磁珠的共同持續刺激下快速大量增殖。

技術領域

本發明屬細胞生物學領域，具體涉及一種體外誘導擴增CD8+T細胞及其功能性細胞亞群的方法。

背景技術

CD8+T 細胞是參與抗腫瘤與抗感染免疫的重要效應細胞，活化的CD8+T 細胞可以迅速釋放高濃度的IFN-γ、IL-2 等細胞因子，具有廣泛的免疫調節作用。在急性感染中，CD8+T細胞接受抗原刺激后，活化并大量增殖，分化成效應性CD8+T細胞（CTL），通過分泌穿孔素和顆粒酶（Granzyme B）殺傷被感染的細胞，或通過Fas-FasL通路誘導被感染的細胞凋亡。當病原清除后，一小部分效應性CD8+T細胞分化成記憶性CD8+T細胞，當相同抗原再次出現時，機體里的記憶性CD8+T細胞會迅速增殖、分化成為效應CTL，進而清除感染的病原體。

CD8+T細胞也是機體抗腫瘤免疫的主要效應細胞之一，通過疫苗主動免疫誘導針對腫瘤特異抗原的CD8+T細胞應答是現代腫瘤免疫治療的發展方向之一。然而，在正常機體能激發有效的CD8+T細胞應答的疫苗，在荷瘤機體中效果并不理想，這與多種免疫調節細胞或因子在腫瘤局部高度富集或高表達，導致腫瘤局部CD8+T細胞無能或耗竭進而形成免疫抑制的微環境相關。腫瘤浸潤性淋巴細胞(Tumor Infiltrating Lymphocyte，TIL)是從腫瘤組織中發現的腫瘤抗原特異性CD4+T與CD8+T等淋巴細胞群，其中CD8+T細胞具有腫瘤殺傷作用。TIL在腫瘤周圍浸潤的程度及CD8+T細胞所占的比例與腫瘤患者的良好預后呈明顯正相關。

在慢性感染和腫瘤發生發展的過程中，抗原特異性的CD8+T細胞由于受到抗原持久的刺激，不能有效分化成記憶性T細胞而逐步演變成功能紊亂的一群細胞，稱之為耗竭性CD8+T細胞。這群細胞表面持續性高表達PD-1抑制性受體，及CD244(2B4)，LAG-3，CD160，TIM-3，CTLA-4等抑制性受體。PD-1已被公認為是耗竭性T淋巴細胞的表面標志。研究發現：在慢性感染性疾病中，聯合阻斷PD-1與CTLA-4、PD-1與LAG-3、PD-1與Tim-3可部分恢復CD8+T細胞的生物學功能；對于腫瘤抗原特異性的CD8+T細胞，聯合阻斷PD-1和Tim-3，或PD-1和LAG-3，也同樣可部分恢復CD8+T細胞功能。盡管阻斷這些通路后可部分恢復耗竭性T細胞的功能，但未能使這些耗竭性T細胞逆轉成非耗竭性T細胞，從而導致腫瘤復發與轉移，不能達到根治的目的。

最近Rosenberg SA的研究表明：外周血中循環的PD1+CD8+T細胞能夠特異性識別黑色素瘤抗原，并且與腫瘤局部表達PD-1的腫瘤侵潤的特異性CD8+T具有相似的T細胞抗原受體（T cell receptor ,TCR），因此PD-1可以作為從外周血獲取腫瘤特異性T細胞的一個生物標記。這為使用腫瘤特異性的淋巴細胞或TCR治療癌癥提供了新的非侵入性策略，并為發展個性化的治療提供新的方法。