[發(fā)明專利]一種體外擴(kuò)增CD8+T細(xì)胞及其細(xì)胞亞群的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710034922.8
• 申請(qǐng)日: 2017-01-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106834228B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-03-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐建青;張曉燕;邱趁麗
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海新長(zhǎng)安生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/0783
• 分類號(hào): C12N5/0783
• 代理公司: 北京德崇智捷知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11467
• 代理人: 衛(wèi)麟

1.一種體外誘導(dǎo)擴(kuò)增PD-1+CD8+T細(xì)胞亞群的方法，其特征在于，在功能性PD-1+CD8+T細(xì)胞亞群培養(yǎng)體系中添加Toll樣受體激動(dòng)劑，抗人CD3抗體和抗人CD28抗體以及重組人細(xì)胞因子IL-7和IL-15，能夠顯著提升PD-1+CD8+T細(xì)胞亞群的擴(kuò)增效率與功能修復(fù)；所述Toll樣受體激動(dòng)劑為T(mén)LR1/2激動(dòng)劑、TLR2/6激動(dòng)劑和TLR5激動(dòng)劑的組合。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，所述TLR1/2激動(dòng)劑包括 Pam3CK4，TLR2/6激動(dòng)劑包括FSL-1，TLR5激動(dòng)劑包括Flagellin。

3.根據(jù)權(quán)利要求1～2所述方法，其特征在于，體外擴(kuò)增PD-1+CD8+T細(xì)胞的具體步驟如下：

a.分離PBMC,使用不同熒光標(biāo)記的抗人CD3抗體、抗人CD8抗體、抗人PD-1抗體標(biāo)記PBMC;室溫避光孵育，離心清洗，用PBS重懸細(xì)胞；

b.使用流式細(xì)胞儀分選外周血單個(gè)核細(xì)胞中CD3+CD8+PD-1+T細(xì)胞;

c.將上述細(xì)胞分選至96孔板中的細(xì)胞靜置1小時(shí)，加入Pam3CK4（ 1-300ng/ml）、FSL-1（1-100ng/ml）、Flagellin（10-100ng/ml）、IL-7（20ng/ml~200ng/ml）、IL-2（10U/ml~100U/ml）、 IL-15（10ng/ml~100ng/ml），抗人CD3抗體和抗人CD28抗體包被的磁珠，磁珠與細(xì)胞比例為1:1，放置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)一周;

d. 第二周將96孔板中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至24孔板，后續(xù)根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)多少，依次將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶、T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶、T175細(xì)胞培養(yǎng)瓶; 每次更換培養(yǎng)皿時(shí)補(bǔ)充相應(yīng)培養(yǎng)基和激動(dòng) 劑,直至培養(yǎng)到所需的細(xì)胞數(shù)量。