[發明專利]一種基于單核苷酸多態性標記的桑樹遺傳分型方法

在審

• 申請號: 201710034912.4
• 申請日: 2017-01-17
• 公開（公告）號: CN106701965A
• 公開（公告）日: 2017-05-24
• 發明（設計）人: 楊永華;廖永輝;湯程貽;方榮俊
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 南京知識律師事務所32207
• 代理人: 胡錫瑜

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種基于單核苷酸多態性標記的桑樹遺傳分型方法。

背景技術

單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP)，是指發生在染色體基因組水平上單個核苷酸變異引起的DNA序列多態性。單核苷酸多態性是許多物種基因組中最常見的變異形式,在基因組中的分布頻率很高。據估計，在人類基因組中大約含有320萬個SNP位點，平均每1000個核苷酸就有一個以上的SNP；水稻第4號染色體每隔250bp左右就有一個SNP。組成DNA的堿基雖然有4種，但SNP一般只有兩種堿基，因此SNP通常被稱為二等位基因。由于SNP的二態性，非此即彼，在基因組中篩選SNPs往往只需要+/-的分析，而不用分析片段的長度，這就有利于發展自動化技術篩選或檢測SNPs。從分子水平上對單個核苷酸的差異進行檢測，單個核苷酸多態性標記可幫助區分個體間遺傳物質的差異。在漫長的進化過程中，生物體形成了自身特有的DNA堿基序列，比較不同物種間或同一物種不同地方品種間的SNP差異，可以了解物種間的親緣關系和進化的生物信息學，從而對不同物種或同一物種不同地方的品種進行精細鑒定和分類。桑葉、桑椹、桑皮、桑根都是傳統的中藥材，在現有國家藥品標準中，含有這4味中藥的復方多達200種以上。桑葉具有降血糖、降血壓、降血膽固醇、抗腫瘤、抗過敏、抗氧化、抗毛細管滲透、利尿等功能。桑枝不僅是《中華人民共和國藥典》記載的祛風濕的常用藥，而且還具有抗炎、降糖、降血脂、提高機體免疫等功能。桑白皮首載于《神農本草經》，其味甘、性寒,能瀉肺平喘及行水消腫，主治肺熱、水腫、糖尿病及骨折等癥，桑白皮的提取液能明顯降低血壓，還有鎮靜作用。現代藥理學研究表明，桑椹具有調節免疫、降血糖、降脂、抗衰老、護肝、抗病毒等作用。目前，桑類中藥原植物均采用桑Morus alba L.,但是，由于桑樹品種較為復雜，古今關于桑類中藥原植物的記述也不一致，而桑樹植物的分類學處理亦很頻繁；同時，由于桑樹植物易于自然雜交，人工雜交的品種亦層出不窮，亦可能導致桑類中藥原植物的復雜性。鑒于此，對桑類中藥的原植物的區分就尤為必要。

發明內容

本發明的目的是提供一種基于單核苷酸多態性標記的桑樹遺傳分型方法，能夠在現有桑樹品種復雜、桑樹分類處理頻繁及古今桑類中藥原植物記述不一致等情況下，通過獲得基因組的大量的核苷酸多態性標記，發現不同地方的桑樹品種之間存在的遺傳變異，為考證桑類中藥原植物提供有力技術支持。

本發明的技術方案：

本發明所述基于單核苷酸多態性標記的桑樹遺傳分型方法，由以下步驟構成：

(1)種群調查及取樣；

(2)DNA提??；

(3)測序；

(4)篩選目標基因TR2222；

(5)根據目標基因TR2222設計引物，正向引物如序列表中SEQ ID NO:1所示；反向引物如序列表中SEQ ID NO:2所示；

(6)PCR擴增；

(7)測序；

(8)序列拼接、比對，鑒定記錄單核苷酸多態性位點。

進一步地，所述目標基因TR2222是通過高通量轉錄組測序后篩選得到。

進一步地，所述PCR擴增的條件參數：94℃預變性5min、94℃30s、55℃30s、72℃1min，35個循環，72℃延伸10min。

進一步地，所述目標基因TR2222在桑樹種群中有8個單核苷酸多態性位點，目標基因TR2222的基因片段如序列表中SEQ ID NO:3所示，其中8個單核苷酸多態性位點分別位于13、115、201、297、384、386、486、551。

進一步地，高通量轉錄組測序的方法：提取樣本總RNA，用Oligo(dT)的磁珠富集分離mRNA，通過反轉錄反應合成雙鏈cDNA，構建轉錄組測序文庫，插入片段長度約為500bp，在Illumina HiSeq2500測序儀上進行高通量測序，使用Trinity軟件對測序片段進行拼接，從而得到基因序列。

本發明的有益效果：