[發明專利]一種基于單核苷酸多態性標記的桑樹遺傳分型方法

在審

• 申請號: 201710034912.4
• 申請日: 2017-01-17
• 公開（公告）號: CN106701965A
• 公開（公告）日: 2017-05-24
• 發明（設計）人: 楊永華;廖永輝;湯程貽;方榮俊
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 南京知識律師事務所32207
• 代理人: 胡錫瑜

1.一種基于單核苷酸多態性標記的桑樹遺傳分型方法，其特征是由以下步驟構成：

(1)種群調查與取樣；

(2)DNA提取；

(3)高通量轉錄組測序，其中，高通量轉錄組測序的方法為：提取樣本總RNA，用Oligo(dT)的磁珠富集分離mRNA，通過反轉錄反應合成雙鏈cDNA，構建轉錄組測序文庫，插入片段長度為500bp，在Illumina HiSeq2500測序儀上進行高通量測序，使用Trinity軟件對測序片段進行拼接，從而得到基因序列；

(4)篩選種群的目標基因TR2222；

(5)根據目標基因TR2222設計引物，正向引物如序列表中SEQ ID NO:1所示；反向引物如序列表中SEQ ID NO:2所示；

(6)PCR擴增，其中，PCR擴增體系為50μl：36.5μl ddH₂O、5μl 10×Buffer(含Mg²⁺)、4μl dNTP Mixture(2.5mM each)、0.5μl TaKaRa Taq(5U/μl)、2μl Template DNA(20-40ng/μl)、1μl正向引物、1μl反向引物；PCR反應參數為：94℃預變性5min、94℃30s、55℃30s、72℃1min，35個循環，72℃延伸10min；

(7)將(6)中PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，回收目標片段，對回收產物進行測序；

(8)序列拼接、比對，鑒定記錄單核苷酸多態性位點；其中，所述目標基因TR2222在桑樹種群中有8個單核苷酸多態性位點，目標基因TR2222基因片段如序列表中SEQ ID NO:3所示，其中8個單核苷酸位點分別位于13、115、201、297、384、386、486、551。