[發明專利]基于鉑納米顆粒催化H2

有效

• 申請號: 201710034420.5
• 申請日: 2017-01-17
• 公開（公告）號: CN106801085B
• 公開（公告）日: 2020-04-24
• 發明（設計）人: 金燕;王彥君;李保新;楊璐竹
• 申請（專利權）人: 陜西師范大學
• 主分類號: C12Q1/48
• 分類號: C12Q1/48
• 代理公司: 西安永生專利代理有限責任公司 61201
• 代理人: 高雪霞

本發明公開了一種基于鉑納米顆粒催化H₂O₂分解產生氣壓變化即時檢測端粒酶活性的方法，當存在活性端粒酶時，磁珠表面修飾的端粒酶引物會與端粒酶結合，使得端粒酶引物沿著其3’末端被延長，并形成一條帶有TTAGGG重復序列的DNA單鏈，這條長的DNA單鏈能夠與許多cDNA雜交，通過將cDNA修飾到鉑納米顆粒表面，就使得鉑納米顆粒固定到了磁珠的表面，然后利用鉑納米顆粒催化過氧化氫分解產生氧氣，體系氣壓發生變化，再采用便攜式氣壓計檢測體系的氣壓值，即可實現對端粒酶活性的即時檢測。本發明檢測方法簡單、快速、靈敏，可以檢測不同種類腫瘤細胞中端粒酶活性的表達水平，在以端粒酶為靶點的癌癥的治療診斷方面具有重要的意義。

技術領域

本發明屬于腫瘤活性檢測技術領域，具體涉及一種基于氣壓變化簡單、靈敏的即時檢測癌細胞中端粒酶活性的方法。

背景技術

端粒是一種位于真核細胞染色體末端的特殊結構，由端粒DNA和端粒相關蛋白構成，其端粒DNA由非編碼的重復序列組成，不同物種的重復序列不同，如人的端粒DNA由5′-TTAGGG-3′重復序列組成，長度為4～15kb不等。端粒的主要功能是保護染色體末端、防止染色體融合、重組和降解。在正常細胞中，隨著細胞的不斷增殖，端粒會逐漸的縮短，當端?？s短到一定程度時，染色體不穩定，細胞就會衰老、死亡。端粒酶是由RNA模板、端粒相關蛋白組成的一種核糖核蛋白酶，具有逆轉錄酶的活性，可以以自身RNA為模板，通過逆轉錄合成端粒重復序列并連接到染色體末端，用來補償細胞分裂時端粒長度的縮短，從而讓腫瘤細胞獲得無限增殖的能力。有研究表明85％～95％的腫瘤細胞中都可以檢測到端粒酶活性呈陽性表達，而在正常細胞中檢測不到端粒酶的活性。因此，端粒酶被認為是一種判斷腫瘤細胞的標示物，靈敏即時地檢測端粒酶活性對于腫瘤的診斷、治療以及預后評估都有很重要的意義(Shay,J.W.,Wright,W.E.Telomerase:A target for cancer therapeutics[J].Cancer Cell 2002,2:257-265.)。

目前為止，在端粒酶活性檢測的方法中最經典的方法是基于聚合酶鏈式反應(PCR)擴增技術的端粒重復序列擴增法(TRAP)(Piatyszek,M.；Kim,N.；Weinrich, S.；Hiyama,K.；Hiyama,E.Wright,W.；Shay,J.Detection of telomerase activity in humancells and tumors by a telomeric repeat amplification protocol(TRAP)[J].Methods Cell Sci.1995,17:1-15.)。該方法是基于聚合酶鏈式反應(PCR)擴增技術，當細胞提取物中存在活性端粒酶時，端粒酶引物被延長產生端粒重復序列。通過PCR擴增技術使延長產物指數倍增加，然后通過凝膠電泳對PCR結果進行表征，從而實現了對細胞提取物中的端粒酶活性高效、靈敏的檢測。但是該方法仍然存在一些缺點，例如操作過程繁瑣復雜，耗時，容易產生假陽性信號，導致實驗結果不可靠。為了克服這些缺點，許多研究工作者試圖發展無需PCR輔助，同時能夠靈敏檢測端粒酶活性的技術。

發明內容

為了克服現有技術中端粒酶活性檢測成本較高、操作復雜、實用性不強等缺陷，本發明提供了一種基于鉑納米顆粒的催化作用，無需通過聚合酶鏈式反應就能夠即時靈敏檢測端粒酶活性的方法。

解決上述技術問題所采用的技術方案由下述步驟組成：

1、將氨基化的磁珠與醛基化的端粒酶引物反應，制備磁珠/端粒酶引物復合物。

2、將鉑納米顆粒與巰基化的cDNA探針反應，制備鉑/cDNA復合物。

3、將待測細胞進行裂解提取端粒酶，以提取的端粒酶RNA為模板，對磁珠/ 端粒酶引物復合物進行擴增。

4、將步驟3的擴增產物和磁珠/端粒酶引物復合物分別與鉑/cDNA復合物進行雜交。