[發明專利]一種東方鲀屬魚類雌雄性別的分子鑒別方法

在審

• 申請號: 201710033765.9
• 申請日: 2017-03-29
• 公開（公告）號: CN106755473A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發明（設計）人: 周勤;劉永新;張紅濤
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院;中國水產科學研究院北戴河中心實驗站
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種東方鲀的分子鑒別方法，屬生物分子檢測領域，主要用于東方鲀屬魚雌雄性別的鑒別。

背景技術

河鲀魚主要是指硬骨魚綱、腹鰭亞綱、鱸形總目、鲀形目、東方鲀屬(Takifugu.sp)的魚。常見的養殖經濟品種有紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)、暗紋東方鲀(Takifugu obscurus)和菊黃東方鲀(Takifugu flavidus)等。在我國魚類養殖業中，東方鲀屬魚是重要養殖品種，目前年總產量已達3萬噸以上。隨著農業部辦公廳、國家食品藥品監督管理總局聯合發布了《關于有條件放開養殖紅鰭東方鲀和養殖暗紋東方鲀加工經營的通知》，相信河鲀養殖業將得到進一步的發展。但由于其養殖大部分是粗放式，品質無法保證，養殖者時虧時贏，收入無法保證。如何提高品質改變這一狀況，越來越引起了魚類研究者的重視。相對于制備細膩鮮美生魚片的魚肉，被稱為“白子”的河鲀雄魚精巢更是價格十倍于魚肉的奢侈品。帶有‘白子’的雄魚售價是雌魚的1.5--2倍。因此，全雄化技術開發成了河鲀養殖業界的共識。全雄魚苗種培育的技術路線是：通過餌料中添加雌性激素或浸浴的方法誘導XY雄魚轉性為“偽雌魚”，“偽雌魚”與正常XY雄魚交配產生YY“超雄魚”，“超雄魚”與XX的正常雌魚交配的后代全部為雄魚。在這個過程中需要將XY“偽雌魚”和YY“超雄魚”從正常的魚苗群中檢出。由于河鲀雌雄個體不具第二性征不能通過外觀鑒別；并且在育種研究中，更不可能采用解剖的方法。以往的方法是通過后代測交的方法來檢出。所以整個過程需要五代半的時間。由于上述三種河鲀魚的成熟周期雄魚為2年，雌魚為3年，這樣整個的實驗過程起碼在十年以上。由于其個體較大，長時間的保養需要大量的水體，餌料，人工成本，加之病害的風險使得這個有重大前途的育種項目幾乎不可能得到開展。因此開發一種準確鑒別河鲀基因性別的分子方法對于開展全雄河鲀育種具有十分重大的意義。

發明專利CN200510045128.0公開了一種東方鲀屬河豚魚早期性別的鑒別方法，該方法首先提取成熟河豚魚尾鰭組織mRNA，利用mRNA反轉錄試劑盒合成雙鏈cDNA，以此為模板，利用cDNA-AFLP法經過預擴增和選擇性擴增、AFLP電泳檢測，獲得雌雄河豚魚尾鰭組織的差異核酸片段，進一步克隆該片段并測序，后根據測得序列設計出特異引物；利用該引物對1齡以上雌雄河豚魚進行驗證。該發明需要經過mRNA提取、反轉錄、AFLP-PCR、電泳等多個過程，不僅實驗過程繁瑣、不易操作而且所需的內切酶等試劑的價格也相對昂貴。

發明專利CN201310278876.8公開了一種快速檢測紅鰭東方鲀幼魚性別差異的引物和方法，該方法使用一組引物，能夠快速檢測紅鰭東方鲀幼魚性別，具體是采用上游引物F1和下游引物R1進行第一輪PCR擴增，進行電泳檢測，呈現625bp條帶的為性別差異基因序列；將第一輪PCR產物稀釋后作為模板，采用上游引物F1和下游引物Inner R5進行第二輪PCR擴增，進行電泳檢測，擴增出334bp條帶的為紅鰭東方鲀雄性個體，該位置無擴增條帶的為紅鰭東方鲀雌性個體。這一發明所述的方法適用范圍窄，并不適用于其它東方鲀屬魚類的鑒別，并且該發明方法包括兩輪PCR擴增鑒定步驟，仍較為繁瑣，更重要的是上述兩種方法均不能鑒別YY“超雄魚”。

因此，建立一種準確、快速、簡便的只通過一輪PCR檢測就能夠鑒定多數東方鲀屬河鲀魚基因性別的方法顯得尤為重要。

發明內容

本發明旨在提供利用分子標記方法對東方鲀屬魚類基因性別進行鑒定的方法及其引物與試劑盒，有助于快速、準確鑒別不同基因性別的東方鲀屬魚類，在東方鲀性別選擇育種和遺傳保種中有極大的應用價值。

為解決上述技術問題，本發明提供了一種用于準確、快速、簡便的能夠鑒定多數東方鲀屬魚類性別的引物，所述引物包括兩條正向引物和一條反向引物，序列如下：

本發明還提供了一種準確、快速、簡便檢測東方鲀屬魚類性別的方法，所述方法包括以下步驟：提取待測東方鲀的DNA樣品；采用所述引物，對DNA樣品進行PCR擴增；將擴增產物進行電泳測試，通過電泳測試結果判斷東方鲀性別。