[發明專利]一種用于熒光原位雜交的動力相關蛋白1基因引物及其cRNA原位雜交探針的制備方法

在審

• 申請號: 201710033286.7
• 申請日: 2017-01-18
• 公開（公告）號: CN106916886A
• 公開（公告）日: 2017-07-04
• 發明（設計）人: 楊雁靈;王亞云;武勝昔;吳菲菲;羅婷婷;拜云虎;王圣明;謝祥軍;陳晶;黃靜;王嘉琪;戴春秋
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙)11350
• 代理人: 湯東鳳

技術領域：

本發明屬于生物醫學領域，涉及一個基因的三種探針及其設計方法，尤其是一種動力相關蛋白1基因cRNA原位雜交的探針及其制備方法。

背景技術：

神經元作為神經系統的基本結構和功能單元，具有高度極化細胞，軸突和樹突，常需要大量能量以維持正常神經回路。而線粒體作為細胞持續供能的場所，在神經元的發育及功能中發揮重要作用。其中線粒體的數量、質量及分布三者直接決定神經元的功能。

線粒體表現在形態上的動力學改變，處于不斷的融合與分裂過程中。線粒體的融合與分裂的動態平衡過程對正常細胞內穩態及生理機能的維持至關重要。其中動力相關蛋白1(dynamin-related protein 1,drp1)是調控線粒體分裂的關鍵蛋白。在線粒體分裂過程中drp1轉移至線粒體外膜上，進行組裝和寡聚化，通過GTP水解作用使線粒體外膜分裂為兩部分。而分裂蛋白主要是通過對drp1的綁定和募集促進分裂的。研究發現，Drp1的活性還與多種神經退行性疾病是緊密相連。因此，對drp1的研究將有助于我們深入理解線粒體在神經系統中的重要功能意義，為疾病的發病機制研究提供新的思路，以期尋找到新的治療靶點。

熒光原位雜交技術是根據已知特異的DNA序列，設計合成特異寡聚核苷酸探針，利用熒光標記與生物體中互補的核苷酸雜交，通過熒光進行精確定量定位，檢測生物體中核苷酸的存在與表達豐度。而關于利用熒光原位雜交技術檢測drp1基因在活體動物中mRNA豐度顯示尚屬空白。

發明內容：

本發明的目的在于克服上述現有技術的缺點，提供一種動力相關蛋白1基因用于熒光原位雜交的引物及探針的設計和制備方法。

本發明的目的是通過以下技術方案來解決的：

一種動力相關蛋白1基因cRNA原位雜交的探針，同一個基因，分別從中間 找出三種不同大小的片段設計并合成引物。

drp1基因片段1的序列為：

5'GCTCAGTGCTGGAAAGCCTAGTGGGCAGGGACCTTCTTCCCAGAGGAACTGGTGTGGTCACCCGGAGACCTCTCATTCTGCAGCTAGTCCACGTTTCACCAGAAGATAAAAGAAAAACAACAGGAGAAGAAAATGAAATTTCAGAGCTGGAGAGTTGAAGCAGAAGAATGGGGTAAATTTCTTCACACCAAAAACAAGCTTTACACAGATTTTATGAAATTCGACAAGAAATTGAAAATGAAACTGAAAGAATTTCAGGAAATAATAAGGGGGTAAGCCCTGAGCCAATCCATC3′

drp1基因片段2的序列為：

5'TTCGTAAAAGGTTGCCCGTGACAAATGAAATGGTGCATAACTTAGTGGCAATTGAGCTAGCGTATATCAACACAAAACACCCCGACTTTGCTGATGCCTGTGGGCTAATGAACAATAATATAGAGGAACAAAGAAGAAACAGGCTAGCAAGAGAGCTGCCTTCAGCTGGATCACGGGACAAGTTAATTCAGGACAACAGAAGAGAAACTAAAAATGTCCCATCTGCAGGTGGTGGGATTGGAGACGGTGGTCAGGAACCAACAACA3′

drp1基因片段3的序列為：

5'CATCTGCAGGTGGTGGGATTGGAGACGGTGGTCAGGAACCAACAACAGGCAACTGGAGAGGAATGCTGAAAACTTCAAAAGCTGAAGAATTACTTGCTGAAGAAAAATCAAAACCAATTCCAATTATGCCAGCAAGTCCACAGAAAGGCCATGCTGTCAATTTGCTAGATGTGCCAGTTCCAGTTGCAA 3′

所述探針的制備方法：

(1)根據drp1基因的Gene bank序列我們設計了3對drp1特異的引物；

(2)構建drp1基因的cRNA原位雜交的探針質粒；將探針質粒轉化細菌后，細菌培養后進行測序；

(3)制備drp1基因的cRNA原位雜交探針；

(4)檢測drp1基因的cRNA探針的原位雜交。

所述步驟(1)drp1基因3對引物如下：

所述步驟(2)按照如下步驟進行：

(a)將小鼠的cDNA用drp1基因的3對特異的引物分別進行PCR擴增；

(b)將PCR產物用OMEGA膠回收試劑盒進行膠回收；