[發明專利]一種用于熒光原位雜交的動力相關蛋白1基因引物及其cRNA原位雜交探針的制備方法

在審

• 申請號: 201710033286.7
• 申請日: 2017-01-18
• 公開（公告）號: CN106916886A
• 公開（公告）日: 2017-07-04
• 發明（設計）人: 楊雁靈;王亞云;武勝昔;吳菲菲;羅婷婷;拜云虎;王圣明;謝祥軍;陳晶;黃靜;王嘉琪;戴春秋
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙)11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種用于熒光原位雜交的動力相關蛋白1基因的cRNA原位雜交探針的制備方法，其特征在于，按照如下步驟：

(1)根據drp1基因的Gene bank序列，設計三對drp1的特異引物，并且分別對此特異引物擴增出drp1基因對應的序列，該序列作為drp1蛋白特異的探針序列；

(2)構建drp1的cRNA原位雜交的探針質粒；將探針質粒轉化細菌后，細菌培養后進行測序；

(3)制備drp1的cRNA原位雜交探針；

(4)檢測drp1的cRNA探針的原位雜交。

2.基于權利要求1所述cRNA原位雜交探針的制備方法，其特征在于，所述探針序列為：

drp1基因片段1的序列為：

5'GCTCAGTGCTGGAAAGCCTAGTGGGCAGGGACCTTCTTCCCAGAGGAACTGGTGTGGTCACCCGGAGACCTCTCATTCTGCAGCTAGTCCACGTTTCACCAGAAGATAAAAGAAAAACAACAGGAGAAGAAAATGAAATTTCAGAGCTGGAGAGTTGAAGCAGAAGAATGGGGTAAATTTCTTCACACCAAAAACAAGCTTTACACAGATTTTATGAAATTCGACAAGAAATTGAAAATGAAACTGAAAGAATTTCAGGAAATAATAAGGGGGTAAGCCCTGAGCCAATCCATC3′

drp1基因片段2的序列為：

5'TTCGTAAAAGGTTGCCCGTGACAAATGAAATGGTGCATAACTTAGTGGCAATTGAGCTAGCGTATATCAACACAAAACACCCCGACTTTGCTGATGCCTGTGGGCTAATGAACAATAATATAGAGGAACAAAGAAGAAACAGGCTAGCAAGAGAGCTGCCTTCAGCTGGATCACGGGACAAGTTAATTCAGGACAACAGAAGAGAAACTAAAAATGTCCCATCTGCAGGTGGTGGGATTGGAGACGGTGGTCAGGAACCAACAACA3′

drp1基因片段3的序列為：

5'CATCTGCAGGTGGTGGGATTGGAGACGGTGGTCAGGAACCAACAACAGGCAACTGGAGAGGAATGCTGAAAACTTCAAAAGCTGAAGAATTACTTGCTGAAGAAAAATCAAAACCAATTCCAATTATGCCAGCAAGTCCACAGAAAGGCCATGCTGTCAATTTGCTAGATGTGCCAGTTCCAGTTGCAA3′。

3.基于權利要求1所述cRNA原位雜交探針的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)按照如下步驟進行：

(a)將小鼠的cDNA用drp1基因的3對特異的引物分別進行PCR擴增；

(b)將PCR產物用OMEGA膠回收試劑盒進行膠回收；

(c)將回收后的產物使用TA克隆載體試劑盒于室溫與多克隆位點兩端具有T7，SP6啟動子的載體進行連接；

(d)將連接好的質粒轉化大腸桿菌DH5α，培養；

(e)使用天跟質粒提取試劑盒提取探針質粒后進行測序。

4.基于權利要求1所述cRNA原位雜交探針的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)按照如下步驟進行：

(a)步驟(2)的到的細菌測序正確后，經判斷確認drp1探針序列插入載體的順序是正向的；

(b)以測序正確的drp1探針質粒為模板，使用T7，SP6特異引物進行PCR擴增；

(c)將PCR產物用OMEGA膠回收試劑盒進行膠回收；

(d)用T7-RNA聚合酶/SP6-RNA聚合酶對探針進行體外轉錄標記。

5.基于權利要求1所述cRNA原位雜交探針的制備方法，其特征在于，所述步驟(4)按照如下步驟進行：

(a)取材并固定包埋組織及切片；

所述取材及固定的方式：將小鼠用7％水合氯醛深麻后，經左心室用0.01mol/L的DEPC-PBS快速沖洗去除血液，再以4％DEPC-多聚甲醛灌注固定24h；將組織轉移并浸沒于30％蔗糖溶液中脫水至沉底48h；

所述的0.01mol/L DEPC-PBS是2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，0.29g NaH₂PO₄·12H₂O，9.0g NaCl用ddH₂O定容至1L后，再加入體積百分比為0.1％的DEPC 1ml放置過夜后，高壓滅菌制成的磷酸鹽緩沖液；

所述4％的多聚甲醛是40g多聚甲醛加入500ml蒸餾水加熱使之解聚溶解后，再加入500ml的0.2mol/L PB緩沖液定容至1000ml，PB的終濃度為0.1mol/L；

所述0.2mol/LPB緩沖液為29.01g Na₂HPO₄·12H₂O，2.965NaH₂PO₄·12H₂O加ddH₂O定容至1000ml，再加入體積百分比為0.1％的DEPC 1ml放置過夜后，高壓滅菌制成的磷酸鹽緩沖液；

所述包埋組織方法：取出固定的組織用包埋劑OTC包埋；將包埋好的組織進行切片：將組織切成25～30μm組織切片，并將切好的切片保存于0.01mol/L的DEPC-PBS中，放于4℃冰箱備用；

(b)選取上述組織切片與室溫條件下經含有2％H₂O₂的0.1mol/L DEPC-PB處理10min以阻斷內源性過氧化物酶；

(c)用0.3％TritonX-100的0.1mol/L DEPC-PB處理20min；

(d)用乙酰化液處理組織切片10min；

(e)用0.1mol/L DEPC-PB清洗組織切片2次，每次10min；

(f)接著將組織放入預雜交液中，58-60℃預雜交1h以封閉非特異結合為點；

所述預雜交液1ml是由500ul的去離子甲酰胺，250ul的20x SSC溶液，200μl的10％阻斷劑，50ul的2％的NLS溶液，10ul的10％的SDS溶液配制而成。

所述10％阻斷劑是由4g的阻斷劑溶于0.1M的馬來酸緩沖液中配制而成；

所述0.1M馬來酸緩沖液為464mg馬來酸，351mg的NaCl溶于ddH₂O中，使用NaOH調節PH至7.5，定容至40ml，高壓滅菌。

(g)在預雜交液中加入drp1探針終濃度為1ng/ul，于58-60℃雜交爐中恒溫孵育16-20h；

(h)雜交后用wash buffer洗滌雜交的組織切片，58℃，2次，每次20min；

所述wash buffer 10ml是由5ml的去離子甲酰胺，1ml的20x SSC溶液，500ul2％的NLS溶于ddH2O中配制而成；

(i)用RNase buffer洗滌上述的組織切片，室溫孵育5min；

所述RNase buffer10ml為1M TRis-HCl,PH8.0，0.5M EDTA，5M NaCl溶于ddH2O中配制而成；

(j)加入終濃度為20ug/ml的RNase A處理，37℃恒溫孵育30min，以消化未結合的cRNA探針；

(k)用2x SSC，2％NLS洗滌上述的組織切片，37℃恒溫孵育2次，每次20min；

(l)用0.2x SSC，2％NLS洗滌上述的組織切片，37℃恒溫孵育2次，每次20min；

(m)將組織切片放在TS7.5溶液中室溫孵育5min；所述TS7.5由1MTRis-HCl，PH8.0，5M NaCl溶于ddH₂O中配制而成；

(n)將組織切片于TBS中室溫封閉1h；所述TBS為含有1％阻斷劑的TS7.5溶液；

(o)在組織切片加入地高辛抗體，效價為1:100-1:1500，室溫孵育過夜；

(p)將上述切片TNT中室溫洗滌2次，每次10min；

(q)將切片用0.1mol/L PB室溫洗滌10min；

(r)加入β-D-Glucose(200mg/ml)1:100稀釋，室溫孵育30min；

(s)將切片用0.1mol/L PB室溫洗滌10min；TNT中室溫洗滌2次，每次10min；

(t)加入含有FITC-avidin(1:500)的TBS溶液避光室溫孵育3h；

(u)將上述切片TNT中室溫洗滌3次，每次10min；

(v)使用熒光封片劑將上述組織切片封片，熒光顯微鏡下觀察。