[發(fā)明專利]Tagln功能研究相關(guān)質(zhì)粒的大量制備方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201710033142.1
• 申請日: 2017-01-18
• 公開（公告）號: CN106754885A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊獻光;李帥洪;王棋文;朱琳;和春翠
• 申請（專利權(quán)）人: 河南師范大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 新鄉(xiāng)市平原專利有限責任公司41107
• 代理人: 于兆惠

1.Tagln功能研究相關(guān)質(zhì)粒的大量制備方法，其特征在于具體過程為：

質(zhì)粒的提取

（1）質(zhì)粒活化，用移液器吸取含有待提取質(zhì)粒的菌液，用涂布棒將稀釋后的菌液均勻涂布于含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，置于恒溫培養(yǎng)箱中于37℃培養(yǎng)過夜；

（2）單克隆搖培，待單克隆菌落長出后，用接種環(huán)從中挑取單克隆接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃、170-190rpm的條件下?lián)u培12h；

（3）擴大培養(yǎng)，從上述培養(yǎng)好的菌液中吸取1mL接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃、170-190rpm的條件下?lián)u培12-16h；

（4）離心收集，將培養(yǎng)至對數(shù)生長后期的含待提質(zhì)粒的菌液倒入離心杯中，配平后于4℃、4300rpm的條件下離心15min，棄上清；

（5）加溶液I，向盛有細菌沉淀物的離心杯中加入冰預冷的溶液I：葡萄糖終濃度0.05mol/L、Tris-HCl終濃度0.025mol/L和EDTA終濃度0.01mol/L，并用干凈的玻璃棒攪拌以重懸沉淀；

（6）加溶液II，向離心杯中加入新配制的溶液II：NaOH 0.2mol/L和SDS 0.01g/L，充分混勻直至內(nèi)容物粘稠有拉絲為止；

（7）加溶液III，向離心杯中加入冰預冷的溶液III：乙酸鉀終濃度5mol/L，內(nèi)容物充分混勻并形成白色絮狀沉淀后冰上放置15min；

（8）離心沉淀，配平后于4℃、4300rpm的條件下離心15min；

（9）過濾上清，將上清液倒入量筒中并用紗布過濾沉淀，量取上清液體積后中加入0.6倍上清液體積的異丙醇，于4℃靜置20min使質(zhì)粒沉淀；

（10）離心收集，將上述液體倒入離心杯中，配平后于4℃、8400rpm的條件下離心15min，棄上清，用體積分數(shù)為70%的乙醇洗滌沉淀，待乙醇揮發(fā)完全后，用TE溶液溶解沉淀；

（11）LiCl純化，加入等體積冰預冷的摩爾濃度為5mol/L的LiCl溶液，于4℃放置10min；

（12）離心收集，配平，于4℃、8400rpm的條件下離心15min，保留上清液，加入2倍上清液體積的無水乙醇，于-20℃靜置20min，使質(zhì)粒沉淀完全；

（13）離心收集，將上述液體倒入離心杯中，配平后于4℃、8400rpm的條件下離心15min，棄上清，用體積分數(shù)為70%的乙醇洗滌沉淀，待乙醇揮發(fā)完全后，用TE溶液溶解沉淀，并在質(zhì)粒溶液中加入RNaseA直至終濃度為20μg/mL，于37℃放置0.5-1h；

質(zhì)粒的純化

（1）在盛有質(zhì)粒溶液的離心管中加入與質(zhì)粒溶液等體積的萃取液I，其中萃取液I是體積比為25:24:1的酚、氯仿和異戊醇的混合物，振蕩混勻，配平后于4℃、8400rpm的條件下離心10min；

（2）取上層水相加入等體積的萃取液II，其中萃取液II是體積比為24:1的氯仿與異戊醇的混合物，振蕩混勻，配平后于4℃、8400rpm的條件下離心10min；

（3）取上層水相加入等體積的PEG-NaCl溶液，混勻，室溫靜置30min；

（4）配平后于4℃、8400rpm的條件下離心15min，沉淀用體積分數(shù)為70%的乙醇潤洗；

（5）待乙醇揮發(fā)完全后，將沉淀溶于水中；

（6）測定260nm波長下質(zhì)粒的吸光度值A(chǔ)，根據(jù)A260=50μg/mL雙鏈DNA計算質(zhì)粒濃度；

（7）根據(jù)OD260/280判斷質(zhì)粒純度，當比值≥1.8時，進一步用瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒，無基因組DNA和RNA條帶污染時，視為合格質(zhì)粒，并于-20℃儲存?zhèn)溆谩?!-- SIPO -->