[發明專利]Tagln功能研究相關質粒的大量制備方法

在審

• 申請號: 201710033142.1
• 申請日: 2017-01-18
• 公開（公告）號: CN106754885A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發明（設計）人: 楊獻光;李帥洪;王棋文;朱琳;和春翠
• 申請（專利權）人: 河南師范大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 新鄉市平原專利有限責任公司41107
• 代理人: 于兆惠

技術領域

本發明屬于TAGLN功能研究相關質粒技術領域，具體涉及一種TAGLN功能研究相關質粒的大量制備方法。

背景技術

Transgelin（Tagln）蛋白是1987年Lees等人（Lees-Miller, Heeley, Smillie, & Kay, 1987）首次從雞胗的平滑肌中分離出來的，因其相對分子量為22kDa而命名為SM22。此后，人們從多個物種中分離出該基因進行研究，從而分別被命名為mouse p27、WS3-10、transgelin和SM22等等（Lawson, Harris, & Shapland, 1997）。Transgelin基因和蛋白的結構在不同種屬間都高度保守，無脊椎動物如線蟲Caenorhabditis elegans（unc-87; Goetnik & Waterson, 1994）和果蠅Drosophila melanogaster（mp20; Ayme-Southgate,Lasko, French, & Purdue, 1989）中也已發現的同源物，它是actin結合蛋白家族（calponin family）中的一員（Lawson et al., 1997）。

Transgelin有一個單一的鈣調理蛋白（calponin）樣重復基序（calponin-likerepeat,CLR），一個用于結合actin的帶正電荷氨基酸殘基。Transgelin普遍表達于脈管和內臟平滑肌，是平滑肌分化的一個早期標記，被平滑肌基因啟動子的CArG盒驅動表達。除此之外，Transgelin也在成纖維細胞和一些上皮細胞中被TGF-β驅動表達。在Transgelin敲除的小鼠中發現，transgelin并不參與平滑肌發育，而是參與鈣非依賴的平滑肌收縮。近來研究表明，transgelin對腫瘤有抑制作用。在前列腺癌、乳腺癌和結腸癌組織中，transgelin表達活性均顯著低于相應的正常組織，并在腫瘤早期階段即顯示出顯著的表達減弱或無表達。在這些腫瘤中，金屬蛋白酶9（MMP-9）表達上調，而transgelin可以抑制基質金屬蛋白酶9（MMP-9）的表達，從而抑制腫瘤。

發明內容

本發明解決的技術問題是提供了一種TAGLN功能研究相關質粒的大量制備方法。

本發明為解決上述技術問題采用如下技術方案，Tagln功能研究相關質粒的大量制備方法，其特征在于具體過程為：

質粒的提取

（1）質粒活化，用移液器吸取含有待提取質粒的菌液，用涂布棒將稀釋后的菌液均勻涂布于含有卡那霉素的LB固體培養基上，置于恒溫培養箱中于37℃培養過夜；

（2）單克隆搖培，待單克隆菌落長出后，用接種環從中挑取單克隆接種于含有卡那霉素的LB液體培養基中，于37℃、170-190rpm的條件下搖培12h；

（3）擴大培養，從上述培養好的菌液中吸取1mL接種于含有卡那霉素的LB液體培養基中，于37℃、170-190rpm的條件下搖培12-16h；

（4）離心收集，將培養至對數生長后期的含待提質粒的菌液倒入離心杯中，配平后于4℃、4300rpm的條件下離心15min，棄上清；

（5）加溶液I，向盛有細菌沉淀物的離心杯中加入冰預冷的溶液I：葡萄糖終濃度0.05mol/L、Tris-HCl終濃度0.025mol/L和EDTA終濃度0.01mol/L，并用干凈的玻璃棒攪拌以重懸沉淀；

（6）加溶液II，向離心杯中加入新配制的溶液II：NaOH 0.2mol/L和SDS 0.01g/L，充分混勻直至內容物粘稠有拉絲為止；

（7）加溶液III，向離心杯中加入冰預冷的溶液III：乙酸鉀終濃度5mol/L，內容物充分混勻并形成白色絮狀沉淀后冰上放置15min；

（8）離心沉淀，配平后于4℃、4300rpm的條件下離心15min；

（9）過濾上清，將上清液倒入量筒中并用紗布過濾沉淀，量取上清液體積后中加入0.6倍上清液體積的異丙醇，于4℃靜置20min使質粒沉淀；

（10）離心收集，將上述液體倒入離心杯中，配平后于4℃、8400rpm的條件下離心15min，棄上清，用體積分數為70%的乙醇洗滌沉淀，待乙醇揮發完全后，用TE溶液溶解沉淀；

（11）LiCl純化，加入等體積冰預冷的摩爾濃度為5mol/L的LiCl溶液，于4℃放置10min；