[發(fā)明專利]一種肝素前體硫酸化修飾酶的表達(dá)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710033024.0
• 申請(qǐng)日: 2017-01-13
• 公開（公告）號(hào): CN106754808A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 尹鴻萍;楊軼偉;王瑩;黃鳳杰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)藥科大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/10
• 分類號(hào): C12N9/10;C12N15/70
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• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

一種肝素前體硫酸化修飾酶的表達(dá)方法，該方法涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及新的核苷酸序列、原核表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建和制備方法。

背景技術(shù)

硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate，HS)是一種多硫酸化多糖，它廣泛存在于細(xì)胞表面及細(xì)胞外基質(zhì)，參與了多種生物反應(yīng)過(guò)程，如胚胎發(fā)育過(guò)程、凝血過(guò)程、病毒感染過(guò)程等等。研究發(fā)現(xiàn)，硫酸乙酰肝素具有多種生物活性，包括抗凝血、抗腫瘤、抗病毒等等，且其生物功能與多糖上修飾的硫酸基團(tuán)密切相關(guān)。

目前，肝素寡糖主要通過(guò)化學(xué)合成的方法進(jìn)行制備。但是對(duì)于合成五糖以上分子量的肝素，單獨(dú)使用化學(xué)合成十分困難。酶具有專一性和高效性，且其反應(yīng)條件溫和，不會(huì)對(duì)大分子的底物的結(jié)構(gòu)造成變化，因此可用于大分子肝素的合成修飾過(guò)程。

在硫酸乙酰肝素的生物合成過(guò)程中，首先合成的是由葡萄糖醛酸和乙酰氨基葡萄糖交替連接形成的主糖鏈，即肝素前體，然后進(jìn)行修飾反應(yīng)獲得具有生物活性的肝素。共有六種酶參與了多糖鏈的修飾反應(yīng)：N-硫酸基轉(zhuǎn)移酶(N-sulfotransferase)、C5異構(gòu)酶(C5 epimerase)、2-O-硫酸基轉(zhuǎn)移酶(2-O-sulfotransferase，2-OST)、3-O-硫酸基轉(zhuǎn)移酶(3-O-sulfotransferase，3-OST)和6-O-硫酸基轉(zhuǎn)移酶(6-O-sulfotransferase，6-OST)，分別對(duì)肝素前體糖鏈的不同位點(diǎn)進(jìn)行修飾。

本發(fā)明通過(guò)分析小鼠的6-OST-3的催化活性區(qū)間蛋白的氨基酸序列，得到相應(yīng)的經(jīng)密碼子優(yōu)化的新雙鏈核苷酸序列(6-ost-3)，利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)并制備了6-OST-3的催化活性區(qū)間蛋白，其作為工具酶對(duì)于大分子肝素的修飾合成具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是使用對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求較低的原核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)小鼠的6-OST-3的催化活性區(qū)間蛋白，獲得可溶性表達(dá)的酶蛋白以用于肝素的修飾合成反應(yīng)。

一種肝素前體硫酸化修飾酶的表達(dá)方法，包括下列步驟：

(1)人工合成兩端帶有NdeI和XhoI酶切位點(diǎn)的6-ost-3序列，經(jīng)雙酶切后插入表達(dá)質(zhì)粒pET-28a的NdeI/XhoI的位點(diǎn)，獲得表達(dá)質(zhì)粒pET-28a/6-ost-3。

(2)將表達(dá)質(zhì)粒pET-28a/6-ost-3轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21感受態(tài)中，獲得重組工程菌。

(3)將工程菌接種至LB培養(yǎng)基中過(guò)夜震蕩培養(yǎng)作為種子液，再將種子液以1％的接種量接種至LB發(fā)酵培養(yǎng)基中，當(dāng)菌液吸光度至0.4-0.6時(shí)加入IPTG在20℃誘導(dǎo)10-12h，離心收集菌體。

(4)菌體重懸于pH 7.4的磷酸緩沖液，加入溶菌酶破碎細(xì)胞，離心收集上清。

(5)溶菌上清經(jīng)鎳柱純化，獲得6-OST-3酶蛋臼溶液。

本發(fā)明利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)，在胞內(nèi)可溶性表達(dá)了6-OST-3酶蛋白，并利用鎳柱純化獲得酶溶液，具有方法簡(jiǎn)單、成本低廉的優(yōu)點(diǎn)。經(jīng)BCA法測(cè)量，酶蛋白溶液中蛋臼含量為2.44mg/mL。經(jīng)測(cè)定，其酶活力為1.53U/mg。

附圖說(shuō)明

圖1為BCA法蛋白含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

圖2為酶活性測(cè)定中的酶反應(yīng)體系說(shuō)明圖

圖3為酶活性測(cè)定中產(chǎn)物PNP的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

具體實(shí)施方式

現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)闡述。

實(shí)施例1：

(1)重組質(zhì)粒的構(gòu)建：人工合成兩端帶有NdeI和XhoI酶切位點(diǎn)的6-ost-3序列，經(jīng)雙酶切后插入表達(dá)質(zhì)粒pET-28a的NdeI/XhoI的位點(diǎn)，獲得表達(dá)質(zhì)粒pET-28a/6-ost-3。

(2)工程菌的構(gòu)建：將表達(dá)質(zhì)粒pET-28a/6-ost-3轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21感受態(tài)中，經(jīng)卡那霉素抗性平板篩選，獲得重組工程菌。

(3)工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)：將工程菌接種至LB培養(yǎng)基中37℃震蕩培養(yǎng)過(guò)夜作為種子液，取1mL種子液接種至100mL的LB發(fā)酵培養(yǎng)基中37℃震蕩培養(yǎng)，當(dāng)菌液吸光度至0.6時(shí)加入IPTG在20℃誘導(dǎo)10h，8000rpm離心10min收集菌體。

(4)菌體破碎：將步驟(3)所收集的菌體重懸于4mL含有500mM的NaCl、20mM磷酸三鈉的pH 7.4的磷酸緩沖溶液中，加入終濃度為1mg/mL的溶菌酶于4℃放置過(guò)夜，12000rpm離心15min收集上清。