[發明專利]一種肝素前體硫酸化修飾酶的表達方法在審
| 申請號： | 201710033024.0 | 申請日： | 2017-01-13 |
| 公開（公告）號： | CN106754808A | 公開（公告）日： | 2017-05-31 |
| 發明（設計）人： | 尹鴻萍;楊軼偉;王瑩;黃鳳杰 | 申請（專利權）人： | 中國藥科大學 |
| 主分類號： | C12N9/10 | 分類號： | C12N9/10;C12N15/70 |
| 代理公司： | 暫無信息 | 代理人： | 暫無信息 |
| 地址： | 211198 江蘇*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 肝素 硫酸 修飾 表達 方法 | ||
【權利要求書】：
1.一種肝素前體硫酸化修飾酶的表達方法，其主要特征在于所述方法包括如下步驟：
(1)人工合成兩端帶有NdeI和XhoI酶切位點的6-ost-3序列，經雙酶切后插入表達質粒pET-28a的NdeI/XhoI的位點，獲得表達質粒pET-28a/6-ost-3。
(2)將表達質粒pET-28a/6-ost-3轉化入大腸桿菌BL21感受態中，獲得重組工程菌。
(3)將工程菌接種至LB培養基中過夜震蕩培養作為種子液，再將種子液以適當的接種量接種至LB發酵培養基中，當菌液吸光度至一定范圍時加入IPTG在誘導表達，離心收集菌體。
(4)菌體重懸于pH7.4的磷酸緩沖液，加入溶菌酶破碎細胞，離心收集上清。
(5)溶菌上清經鎳柱純化，獲得6-OST-3酶蛋白溶液。
2.根據權利1所要求的方法，其特征是在于步驟(1)中的6-ost-3序列為新的人工合成序列。
3.根據權利1所要求的方法，其特征是在于步驟(3)中的接種量為1％。
4.根據權利1所要求的方法，其特征是在于步驟(3)中的誘導條件為：加入IPTG的終濃度為0.8-1.0mmol/L，誘導溫度為20℃，誘導時間為10-12h。
5.根據權利1所要求的方法，其特征是在于步驟(5)中鎳柱純化的清洗緩沖液為含10mM咪唑的磷酸緩沖溶液，洗脫緩沖液為含100mM咪唑的磷酸緩沖溶液。
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