[發明專利]一種恒溫條件下合成核酸的方法

有效

• 申請號: 201710031322.6
• 申請日: 2017-01-17
• 公開（公告）號: CN106636071B
• 公開（公告）日: 2020-07-17
• 發明（設計）人: 杜昱光;毛瑞;劉洪濤;王倬
• 申請（專利權）人: 中國科學院過程工程研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6806
• 代理公司: 北京方安思達知識產權代理有限公司 11472
• 代理人: 王宇楊;武玥

本發明涉及基因工程技術領域，具體地，本發明涉及一種恒溫條件下合成核酸的方法。本發明包括以下步驟：1)提供一種核酸，所述核酸的3’末端具有與同一條鏈上的F1c區退火的F1r區，并且通過所述F1r區與Flc區的同時退火可形成螺旋環；2)以步驟1)所述核酸為模板合成其自身的互補鏈；3)通過聚合酶催化鏈置換型互補鏈合成反應而進行互補鏈合成，以置換步驟2)中所合成的互補鏈。本發明所述寡核苷酸在引物的5’?側所提供的核苷酸序列，基本上與以該引物為合成起點而合成的區域相同。本發明在單純試劑的組成上實現了基于恒溫反應的核酸合成。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，具體地，本發明涉及一種恒溫條件下合成核酸的方法，特別涉及由特異性核苷酸序列構成的可形成特殊結構核酸的合成方法，及基于該特異性核酸序列的一種有用的擴增核酸的方法。

背景技術

生物體所攜帶基因信息的生物體的最根本差異，基于核苷酸序列互補性的分析方法可直接分析基因所攜帶的遺傳特征。該分析是一種鑒定遺傳疾病、癌變、微生物等非常強有力的方法。當樣品中靶基因含量非常少時一般不易檢測，因此必須對靶基因進行擴增或使其檢測信號放大。作為擴增靶基因的方法，PCR方法被認為是最經典方法(Saiki，Gelfandet al.1988)，亦是體外核酸序列擴增應用最為普遍的技術。該方法指數式擴增結果使其具有高靈敏度，確立了其在分子生物學方法檢測領域的地位，經幾十年發展已有系列成熟產品。此外，擴增產物可回收使用，因此作為一種支持遺傳工程技術如基因克隆和結構決定的重要工具，亦得到廣泛應用。然而，PCR方法明顯有下述的問題：實際操作中必須要用專門的程序溫度控制系統；擴增反應的指數式上升導致難于定量；樣品和反應溶液易受到外部污染，假陽性問題較為突出。

當前人類基因組計劃已經完成，單核苷酸多態性(SNPs)顯示出數量多、分布廣泛的特點，故其分析逐步受到重視。通過設計引物使其核苷酸序列包含SNPs，依靠PCR擴增來檢測SNPs是可行的，即通過是否存在與引物互補的核苷酸序列可通過是否存在反應產物的決定得出推斷。然而，一旦PCR中偶然誤合成互補鏈，在接下去的反應中該產物以模板運行，就會造成錯誤的結果。實際應用中，若引物末端僅一個堿基不同則將很難嚴格控制PCR，故必須改進特異性使PCR更好應用于SNPs的檢測上。

另一方面，相較于繁瑣的程序溫控過程合成核酸，科學家亦開發出在恒溫條件下合成核酸的技術(Zhao，Chen et al.2015)，主要包括以下幾種：依賴核酸序列的擴增(NASBA)、滾環擴增(RCA)，鏈置換擴增(SDA)、環介導等溫擴增(LAMP)、依賴解旋酶的擴增(HDA)、重組聚合酶擴增(RPA)。

NASBA，也稱TMA(轉錄介導擴增方法)不需要復雜的溫度控制。該方法通過DNA聚合酶以靶RNA為模板，加入連接有T7啟動子的探針而得以合成，第二探針進入雙鏈使產物得以生成，接著以生成的雙鏈DNA為模板通過T7RNA聚合酶轉錄而擴增得到大量的RNA產物。NASBA需要熱變性步驟直到雙鏈DNA形成，但是接下去的轉錄反應在等溫條件下通過T7RNA聚合酶得以進行。必須要用多種酶組合例如反轉錄酶，RNase H，DNA聚合酶和T7RNA聚合酶，然而多種酶的組合對于費用是不利的。同時由于復雜的多種酶反應條件設定，該方法很難作為一般的分析方法得以推廣。

RCA(滾環擴增，Rolling Circle Amplification)旨在模仿微生物中環狀DNA的滾環復制過程，對于環狀單鏈DNA模板，與該模板相結合的引物在原方法僅能實現對于環狀核酸的擴增。為使得該方法可通用于線性DNA的擴增，通過掛鎖探針(padlock probe)或環形探針互補的單鏈DNA顯示具有一系列核苷酸序列與掛鎖探針(padlock probe)或環形探針互補的單鏈DNA在靶核苷酸存在下可被連續的合成(Lizardi，Huang et al.1998)。該方法亦存在需多種酶的問題。而且，互補鏈合成的啟動取決于連接兩鄰近區的反應，并且其特異性基本上與LCR中的相同。