[發明專利]一種恒溫條件下合成核酸的方法

有效

• 申請號: 201710031322.6
• 申請日: 2017-01-17
• 公開（公告）號: CN106636071B
• 公開（公告）日: 2020-07-17
• 發明（設計）人: 杜昱光;毛瑞;劉洪濤;王倬
• 申請（專利權）人: 中國科學院過程工程研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6806
• 代理公司: 北京方安思達知識產權代理有限公司 11472
• 代理人: 王宇楊;武玥

1.一種恒溫條件下合成核酸的方法，所述方法用于非疾病診斷和治療目的，包括以下步驟：

1）提供一種第二核酸，所述第二核酸的3’末端具有與同一條鏈上的F1c區退火的F1r區，并且通過所述F1r區與Flc區的同時退火形成螺旋環；其中，

所述第二核酸的制備方法，包括以下步驟：

i）退火步驟，使第一寡核苷酸I與模板的F1c區退火，其中該模板的3’末端包括F1c區和位于F1c區3’側的F2c區，該模板的5’末端包括R1區和位于R1區5’側的R2區，其中所述第一寡核苷酸I，包括R1r區與Fl區，所述Rlr區與F1區的5’側相連，其中，

F1區：具有與模板F1c區互補的核苷酸序列的區，

R1r區：具有與模板R1區反向的核苷酸序列的區；

ii）合成第一核酸的步驟，所述第一核酸具有與所述模板互補的核苷酸序列，此步驟以第一寡核苷酸I的F1區作為合成的起點合成第一核酸，所述第一核酸的5'末端具有與模板F1c區互補的F1區；

iii）利用聚合酶催化鏈置換反應置換步驟ii）中合成的第一核酸，其中與模板中的F1c的3’側的F2c區退火的第一外引物I用作合成的起點，和

iv）退火步驟，使第二寡核苷酸II與步驟iii）所得第一核酸的R1c區退火，其中所述第二寡核苷酸II包括R1區和F1r區，并且Flr區與R1區的5’側相連，第二寡核苷酸II為第一寡核苷酸I的反向序列；其中，

R1區：具有與第一核酸的R1c區互補的核苷酸序列的區，

Flr區：具有與第一核酸的F1區反向的核苷酸序列的區；

v）以所述第二寡核苷酸II作為合成的起點，合成第二核酸，并利用聚合酶催化鏈置換反應置換該第二核酸獲得所述提供的第二核酸；其中，置換第二核酸時，與第一核酸中的R1c的3’側的R2c區退火的第二外引物II用作合成的起點；

2）以步驟1）提供的第二核酸為模板，該模板自身的R1rc區與R1區退火，而與Flc區退火的F1r區的3'末端組成螺旋環，以此作為合成起點合成其自身的互補鏈；

3）通過聚合酶催化鏈置換型互補鏈合成反應而進行互補鏈合成，以置換步驟2）中所合成的互補鏈，獲得核酸。

2.根據權利要求1所述的合成核酸的方法，其特征在于，步驟i）所述模板為RNA，步驟ii）中的第一核酸通過具有反轉錄酶活性的酶來合成。

3.根據權利要求1-2中任一所述的合成核酸的方法，其特征在于，步驟3）合成的核酸是在其一條鏈上具有首尾互補核苷酸序列的核酸。

4.根據權利要求1-2中任一所述的合成核酸的方法，其特征在于，每種寡核苷酸與其在模板中的互補區之間的解鏈溫度存在以下的關系：

第一外引物I或第二外引物II或模板 3'側區的解鏈溫度≤F2c或F2的解鏈溫度≤F1c或F1的解鏈溫度，并且，

第一外引物I或第二外引物II或模板 3'側區的解鏈溫度≤F2c或F2的解鏈溫度≤Rlc或Rl的解鏈溫度，并且，

第一外引物I或第二外引物II或模板 3'側區的解鏈溫度≤R2c或R2的解鏈溫度≤F1c或F1的解鏈溫度，并且，

第一外引物I或第二外引物II或模板 3'側區的解鏈溫度≤R2c或R2的解鏈溫度≤Rlc或Rl的解鏈溫度。

5.根據權利要求1所述的合成核酸的方法，其特征在于，所得到的第二核酸通過引入加速探針Xin的方法使得核酸擴增加速進行，其中Xin位于第二核酸的F1c區到R1區的中間區段。

6.根據權利要求1-2任一所述的合成核酸的方法，其特征在于，以步驟3）置換后的互補鏈為模板重復步驟1）-3）合成核酸。