[發明專利]一種根癌農桿菌介導的草莓高效穩定的遺傳轉化方法

在審

• 申請號: 201710029435.2
• 申請日: 2017-01-16
• 公開（公告）號: CN106755086A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發明（設計）人: 湯浩茹;江雷雨;陳品文;肖婕;宋霞;陳清;王小蓉;羅婭;張勇;孫勃
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙)11350
• 代理人: 湯東鳳

技術領域

本發明涉及植物生物學技術領域，尤其涉及一種根癌農桿菌介導的草莓高效穩定的遺傳轉化方法。

背景技術

根癌農桿菌介導法是草莓遺傳轉化的重要方法，它是以草莓的葉片、葉柄、原生質體和愈傷組織等為外植體，經農桿菌浸染后，通過抗生素篩選、器官發生獲得再生植株，其中以“葉盤法”應用的最為普遍。

傳統的“葉盤法”存在遺傳轉化效率低、雜菌污染嚴重、不定芽再生困難、容易產生嵌合體和假陽性植株等問題，從而導致篩選工作量大、轉基因植株獲取困難。而隨著草莓基因組學研究的深入，揭示基因功能及其表達時空性已成為后基因組時代的重要課題，轉基因技術作為研究基因功能的最有效的手段之一已發揮著越來越重要的作用。因此，建立一種高效穩定的草莓遺傳轉化方法對批量驗證基因功能就顯得尤為重要。

發明內容

為克服現有技術存在的上述技術問題，本發明提供了一種根癌農桿菌介導的草莓高效穩定的遺傳轉化方法，其優化了遺傳轉化的步驟，從而大幅度提高了草莓轉基因效率，解決了傳統農桿菌介導法轉化效率低，易產生嵌合體，篩選困難，工作量大的問題，極大的提高了遺傳轉化效率，同時顯著降低了再生芽的假陽性率。

本發明解決上述技術問題的技術方案如下：一種根癌農桿菌介導的草莓高效穩定的遺傳轉化方法,其包括：

草莓無菌苗的預培養：取草莓無菌苗，獲得其葉盤或剪成小塊，置于M1培養基中進行暗培養，獲得預培養葉片；

農桿菌活化：取根癌農桿菌陽性單克隆于含抗生素的YEB液體培養基中，黑暗條件下振蕩培養，獲得菌液；取獲得的菌液離心收菌，獲得菌體沉淀；將獲得的菌體沉淀重懸于M2培養基中，振蕩培養，獲得用于侵染的菌液；

侵染：將獲得的所述預培養葉片置于所述用于侵染的菌液中，進行侵染處理；

共培養：吸干經侵染處理后的葉片表面的菌液，置于M3培養基中，進行暗培養；

延遲篩選：用M4洗滌液洗滌經共培養結束后的葉片，并吸干其表面的菌液，再接種于M5培養基上，進行暗培養；

篩選：將延遲篩選結束后的葉片轉移至M6培養基中，光照和黑暗交替培養，培養結束后，切除壞死組織，將俞傷組織部分轉接于M7培養基中，光照和黑暗交替培養，直到分化出不定芽；

生根：待芽長長后，將其切下轉移至M8培養基中再培養，得到完整植株。

在上述技術方案的基礎上，本發明還可以做如下改進。

進一步，所述根癌農桿菌為LBA4404農桿菌或GV3101農桿菌。

進一步，所述M3培養基的成分包括MS、B5維生素、3％蔗糖、0.25％植物凝膠、0.1～3mg/L激素、100μmol/L乙酰丁香酮及50～150μmol/L的а-硫辛酸，且其PH值為5.5。

采用上述進一步方案的有益效果是：利用含有上述成分的M3培養基，通過加入適宜濃度的а-硫辛酸，能夠緩解農桿菌浸染植物過程中產生的“氧爆反應”，清除活性氧和自由基，減緩植物組織的褐化，促進轉基因芽的再生。

進一步，所述M5培養基的成分包括MS、B5維生素、3％蔗糖、0.25％植物凝膠、0.1～3mg/L激素、200～500mg/L抗生素及50～150μmol/L井岡霉素A，且其PH值為5.8。

采用上述進一步方案的有益效果是：在草莓遺傳轉化過程中添加適宜濃度的а-硫辛酸和井岡霉素A，極大的提高了遺傳轉化效率，同時顯著降低了再生芽的假陽性率，轉化效率是傳統的農桿菌介導法的兩倍以上。

進一步，所述M1培養基的成分包括MS、B5維生素、3％蔗糖、0.25％植物凝膠和0.1～3mg/L激素；且其PH值為5.8。

進一步，所述M2培養基的成分包括MS、B5維生素、2％蔗糖及100μmol/L的乙酰丁香酮，且其PH值為5.5。

進一步，所述M4洗滌液的成分包括MS、B5維生素、3％蔗糖及200～500mg/L抗生素，且其PH值為5.8。

進一步，所述M6、M7培養基的成分均包括MS、B5維生素、3％蔗糖、0.25％植物凝膠、0.1～3mg/L激素及200～500mg/L抗生素，且M6、M7培養基的PH值均為5.8；其中所述M6中，所加入的抗生素包括5mg/L的潮霉素或10mg/L的硫酸卡那霉素，所述M7中，所加入的抗生素包括10mg/L潮霉素或30mg/L硫酸卡那霉素。

進一步，所述M8培養基的成分包括MS或1/2MS、0～0.5mg/L激素和1～5mg/L抗生素，其PH為5.8。