[發(fā)明專利]一種根癌農桿菌介導的草莓高效穩(wěn)定的遺傳轉化方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710029435.2
• 申請日: 2017-01-16
• 公開（公告）號: CN106755086A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發(fā)明（設計）人: 湯浩茹;江雷雨;陳品文;肖婕;宋霞;陳清;王小蓉;羅婭;張勇;孫勃
• 申請（專利權）人: 四川農業(yè)大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙)11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種根癌農桿菌介導的草莓高效穩(wěn)定的遺傳轉化方法,其特征在于，包括：

草莓無菌苗的預培養(yǎng)：取草莓無菌苗，獲得其葉盤或剪成小塊，置于M1培養(yǎng)基中進行暗培養(yǎng)，獲得預培養(yǎng)葉片；

農桿菌活化：取根癌農桿菌陽性單克隆于含抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，黑暗條件下振蕩培養(yǎng)，獲得菌液；取獲得的菌液離心收菌，獲得菌體沉淀；將獲得的菌體沉淀重懸于M2培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)，獲得用于侵染的菌液；

侵染：將獲得的所述預培養(yǎng)葉片置于所述用于侵染的菌液中，進行侵染處理；

共培養(yǎng)：吸干經侵染處理后的葉片表面的菌液，置于M3培養(yǎng)基中，進行暗培養(yǎng)；

延遲篩選：用M4洗滌液洗滌經共培養(yǎng)結束后的葉片，并吸干其表面的菌液，再接種于M5培養(yǎng)基上，進行暗培養(yǎng)；

篩選：將延遲篩選結束后的葉片轉移至M6培養(yǎng)基中，光照和黑暗交替培養(yǎng)，培養(yǎng)結束后，切除壞死組織，將俞傷組織部分轉接于M7培養(yǎng)基中，再光照和黑暗交替培養(yǎng)，直到分化出不定芽；

生根：待芽長長后，將其切下轉移至M8培養(yǎng)基中再培養(yǎng)，得到完整植株。

2.根據權利要求1所述的根癌農桿菌介導的草莓高效穩(wěn)定的遺傳轉化方法,其特征在于，所述根癌農桿菌為LBA4404農桿菌或GV3101農桿菌。

3.根據權利要求1所述的根癌農桿菌介導的草莓高效穩(wěn)定的遺傳轉化方法,其特征在于，所述M3培養(yǎng)基的成分包括MS無機鹽、B5維生素、3％蔗糖、0.25％植物凝膠、0.1～3mg/L激素、100μmol/L乙酰丁香酮及50～150μmol/L的а-硫辛酸，且其PH值為5.5。

4.根據權利要求3所述的根癌農桿菌介導的草莓高效穩(wěn)定的遺傳轉化方法,其特征在于，所述M5培養(yǎng)基的成分包括MS、B5維生素、3％蔗糖、0.25％植物凝膠、0.1～3mg/L激素、200～500mg/L抗生素及50～150μmol/L井岡霉素A，且其PH值為5.8。

5.根據權利要求1至4任一項所述的根癌農桿菌介導的草莓高效穩(wěn)定的遺傳轉化方法,其特征在于，所述M1培養(yǎng)基的成分包括MS、B5維生素、3％蔗糖、0.25％植物凝膠和0.1～3mg/L激素；且其PH值為5.8。

6.根據權利要求1至4任一項所述的根癌農桿菌介導的草莓高效穩(wěn)定的遺傳轉化方法,其特征在于，所述M2培養(yǎng)基的成分包括MS、B5維生素、2％蔗糖及100μmol/L的乙酰丁香酮，且其PH值為5.5。

7.根據權利要求1至4任一項所述的根癌農桿菌介導的草莓高效穩(wěn)定的遺傳轉化方法,其特征在于，所述M4洗滌液的成分包括MS、B5維生素、3％蔗糖及200～500mg/L抗生素，且其PH值為5.8。

8.根據權利要求1至4任一項所述的根癌農桿菌介導的草莓高效穩(wěn)定的遺傳轉化方法,其特征在于，所述M6、M7培養(yǎng)基的成分均包括MS、B5維生素、3％蔗糖、0.25％植物凝膠、0.1～3mg/L激素及200～500mg/L抗生素，且M6、M7培養(yǎng)基的PH值均為5.8；其中所述M6中，所加入的抗生素包括5mg/L的潮霉素或10mg/L的硫酸卡那霉素，所述M7中，所加入的抗生素包括10mg/L潮霉素或30mg/L硫酸卡那霉素。

9.根據權利要求1至4任一項所述的根癌農桿菌介導的草莓高效穩(wěn)定的遺傳轉化方法,其特征在于，所述M8培養(yǎng)基的成分包括MS或1/2MS、0～0.5mg/L激素和1～5mg/L抗生素，其PH為5.8。

10.根據權利要求1至4任一項所述的根癌農桿菌介導的草莓高效穩(wěn)定的遺傳轉化方法,其特征在于，在延遲篩選培養(yǎng)中，接種于M5培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)的條件是22℃條件下暗培養(yǎng)6天；在篩選培養(yǎng)中，所述光照和黑暗交替培養(yǎng)具體為16小時的光照培養(yǎng)和8小時的黑暗培養(yǎng)交替培養(yǎng)15～20天，在交替培養(yǎng)15～20天后再重復篩選培養(yǎng)過程一次。