[發明專利]基于凝血酶和凝血因子的雙靶點抗凝活性物質的液相色譜-質譜篩選方法

有效

• 申請號: 201710029357.6
• 申請日: 2017-01-16
• 公開（公告）號: CN106814153B
• 公開（公告）日: 2020-06-16
• 發明（設計）人: 許哲;劉若男;管華詩
• 申請（專利權）人: 青島海洋生物醫藥研究院股份有限公司
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06;G01N30/02
• 代理公司: 青島合創知識產權代理事務所(普通合伙) 37264
• 代理人: 王曉曉

本發明提供了一種基于凝血酶和凝血因子的雙靶點抗凝活性物質的液相色譜?質譜篩選方法。具體包括：建立靶標酶酶反應產物的定量方法；獲得用于篩選的酶反應溶液；進行高效液相?質譜聯用分析。本發明保證了所述篩選方法的準確度高、干擾少、靈敏度高和重現性強；質譜方法的自動化進樣使得該篩選方法可以連續分析大量的樣品，使該方法兼具高通量的特點。該篩選方法，可以用于大批量樣品庫的篩選，更具實用性，且篩選出的活性物質作用靶點明確，為后續藥物的開發奠定了理論基礎。本發明可以降低干擾、特異性高，操作簡便、節約時間，有效的提高篩選效率和篩選成功率。

技術領域

本發明屬于藥物分析技術領域，具體涉及基于凝血酶和凝血因子的雙靶點抗凝活性物質的液相色譜-質譜篩選方法。

背景技術

酶是機體中重要的藥物靶點之一，現有的藥物近半數都是小分子酶抑制劑。運用酶靶點篩選抑制劑已有較多研究：有報道將文丘里氏管應用于質譜接口技術，開發了文丘里-常壓超聲噴霧離子源質譜系統，并將其用于高通量篩選血管緊張素轉換酶的抑制劑（Liu, N., et al., Analytica Chimica Acta, 2016. 913: 86-93.）；近幾年，酶固定化技術和磁性納米顆粒結合的方法開發報道也很多，例如采用酶固定化磁珠結合高效液相色譜-紫外檢測技術用于篩選GSK-3β的抑制劑（Li, Y., et al., Journal ofChromatography A, 2015. 1425: 8-16.）和從藥用植物中快速發現α-淀粉酶抑制劑（Li,Y., et al., Journal of Chromatography B, 2014. 960: 166-173.）；另外，Kumar等人采用計算機輔助藥物設計概念，利用3D形狀匹配，靜電勢相似性評估和分子對接的方法，使用虛擬篩選和骨架轉移法篩選具有SUMO E1抑制活性的新穎結構（Kumar, A., et al.,Bioorganic Medicinal Chemistry Letters, 2016. 26(4): 1218-1223.）；血紅素肽片段具有類似于過氧化酶的活性，在雙氧水存在下可以氧化有機分子。基于這個原理，開發了用于胰蛋白酶活性測定和抑制劑篩選的熒光檢測方法（Zhang, L., et al., Talanta,2016. 161: 535-540.）；半胱胺封端的CdTe量子點（QDs），其表面的氨基會通過靜電作用和氫鍵作用與加入的ATP相互作用，從而產生明顯的熒光增強作用。有學者利用這個現象，開發了用于酸性磷酸酶（ACP）活性測試及其抑制劑的篩選（Wang, J., et al., Sensors andActuators B: Chemical, 2016. 234: 470-477.）；Morris團隊開發熒光生物傳感器探測細胞周期蛋白依賴性激酶，并監控了他們在體外和活細胞中含量和活性的變化，以發現新的用于癌癥治療的抑制劑（Prével, C., et al., European Journal of MedicinalChemistry, 2014. 88: 74-88.）；現今，將樣品前處理、在線分離和分析等多種技術聯合用于篩選酶抑制劑的報道屢見不鮮，既有利用新型樣品制備和在線HPLC-DAD-MS / MS-BCD聯合分析，快速篩選和表征中藥提取物中的特異性α-葡萄糖苷酶抑制劑（Li D.Q., et al.,Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2014. 88 : 130–135）；也有通過在線固相萃取和HPLC聯用使用紫外檢測器測定花生四烯酸，從而篩選細胞溶質磷脂酶A₂α的抑制劑（Hanekamp, W. and M. Lehr, Journal of Chromatography B, 2012. 900:79-84.）；還有通過組合HPLC-HRMS-SPE-NMR方法得到可食用海藻的高分辨率α-葡萄糖苷酶抑制譜，并鑒定了其中的α-葡萄糖苷酶的抑制劑（Liu, B., et al., Food Chemistry,2016. 203: 16-22.）；Zhou等用超濾-高效液相色譜法對茯苓的不同溶劑提取部位進行了β-葡萄糖苷酶抑制活性的篩選，并對有活性的部位結合高速逆流色譜與Sephadex LH-20色譜兩種技術進行了進一步的分離純化，得到了3種抑制活性的化合物，并對其進行了結構解析（Zhou, X., et al., Journal of Chromatography B, 2015. 985: 149-154.）。近年來，新興的納米微球技術、酶固定化技術、熒光量子點成像技術、表面等離子共振技術和液相-質譜聯用技術等被整合起來應用于酶抑制劑篩選，形成一系列新的高效率、高通量的篩選技術。