[發明專利]基于凝血酶和凝血因子的雙靶點抗凝活性物質的液相色譜-質譜篩選方法

有效

• 申請號: 201710029357.6
• 申請日: 2017-01-16
• 公開（公告）號: CN106814153B
• 公開（公告）日: 2020-06-16
• 發明（設計）人: 許哲;劉若男;管華詩
• 申請（專利權）人: 青島海洋生物醫藥研究院股份有限公司
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06;G01N30/02
• 代理公司: 青島合創知識產權代理事務所(普通合伙) 37264
• 代理人: 王曉曉

1.基于凝血酶和凝血因子的雙靶點抗凝活性物質的液相色譜-質譜篩選方法，其特征在于所述篩選方法包括如下步驟：

（1）配制靶標酶酶反應產物的系列標準溶液，進行高效液相-質譜聯用分析，建立靶標酶酶反應產物的定量方法；

（2）將凝血酶和凝血因子及其對應的底物與待篩選化合物混合后，得到用于藥物篩選的酶反應溶液，30-50 ℃下反應直至反應完成；將凝血酶和凝血因子及其對應的底物與去離子水混合后得到空白對照；

（3）然后進行高效液相-質譜聯用分析：測得所述靶標酶酶反應產物的峰面積，以抑制率為評價標準：抑制率=1-(待篩選化合物的質譜響應峰面積/空白對照的質譜響應峰面積)，篩選出具有抗凝作用的活性物質；

所述凝血因子為凝血因子Xa；

所述步驟（1）中靶標酶酶反應產物為對硝基苯胺；

所述步驟（1）和（3）中高效液相色譜的條件為：采用C18色譜柱；流動相為體積比60:40的甲醇和水的混合液；流速為0.4-0.6 mL/min；進樣量為2-20 μL；流動相洗脫時間為0.5-1.5分鐘；

所述步驟（1）和（3）中質譜條件為電噴霧質譜正離子模式；碎裂電壓：50-150 V；干燥氣溫度：300-350 ℃；霧化器電壓：10-20 psi；干燥氣流速：8-10 L/min；毛細管電壓：3500-4000 V；定量方式為多重離子監測模式，采用的離子對為：m/z 139-122，碰撞能量CE為8-20V；

所述步驟（2）和（3）之間還設有步驟：對用于藥物篩選的經酶反應后的溶液進行樣品分離純化；

所述分離純化依次包括除蛋白和除鹽步驟；

所述除蛋白步驟為：向所述酶反應后的溶液中加入與所述步驟（2）的酶反應溶液等體積的除蛋白劑，超速離心取上清；所述除蛋白劑為乙腈；

使用苯磺酸基強陽離子交換型固相萃取柱對除蛋白后的酶反應上清液進行除鹽處理；

所述除鹽步驟如下：

（1）活化：加入1 mL的甲醇活化固相萃取柱的填充材料；

（2）平衡：分別加入1 mL的去離子水和1 mL乙腈水溶液平衡固相萃取小柱，所述乙腈水溶液的體積比為90%，并用乙酸調pH值為3.65-4；

（3）上樣：將100 μL的上述除蛋白后的酶反應上清液加入固相萃取柱中，將柱中自然濾下的反應液收集在離心管中；

（4）洗脫：加入1 mL乙腈水溶液進行固相萃取柱勻速洗脫，所述乙腈水溶液的體積比為90%，并用乙酸調pH值為3.65-4，速度控制在5 mL·min^-1，洗脫液也收集到離心管中；

（5）濃縮：采用氮吹儀，控制金屬浴溫度85 ℃下加熱，直至洗脫液被吹干；

（6）復溶：加入100 μL 體積比為50%的乙腈水對吹干組分進行復溶，渦旋，離心速度為12000 rmp，離心時間5 min取上清。