[發明專利]建立乳腺癌易感基因突變動物模型的方法及應用

在審

• 申請號: 201710029029.6
• 申請日: 2017-01-16
• 公開（公告）號: CN107058384A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發明（設計）人: 王寧;王雅杰;熊安穩;王一然;劉傳;吳家雪
• 申請（專利權）人: 上海長海醫院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;A01K67/027;A61K49/00
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司31253
• 代理人: 馮子玲

技術領域

本發明涉及一種建立乳腺癌易感基因突變動物模型的方法及應用，屬于生物技術領域。

背景技術

目前國內外對遺傳性多態位點的研究多局限于疾病表型和基因多態性之間相關性。缺乏進一步闡述基因多態性改變的功能學意義的深入研究。

我們開展臨床病例-對照研究發現，針對HR通路中DNA雙鏈損傷修復重要基因CHEK2突變進行研究。

而且對于醫學研究來講，培育出與病癥相應的動物模型是加快研究進度，提高研究效果的必然路徑。然而由于培育技術的局限性，想要建立一種恰當的動物模型，仍然需要大量的探索。

發明內容

本發明的目的在于提供一種建立乳腺癌易感基因突變動物模型的方法及應用，為研究乳腺癌易感基因突變提供平臺。

目前我們的研究組在早發性乳腺癌人群中發現了新的錯義突變CHEK2 Y390C(390位的酪氨酸突變為半胱氨酸)，該突變攜帶者在150名早發性乳腺癌人群中的明顯比例高于正常年輕女性，提示該突變和早發性乳腺癌的遺傳易感性有關。迄今未見其他關于CHEK2 Y390C的報道。我們推斷CHEK2 Y390C突變可能成為中國早發性乳腺癌特有的多 態性位點。在體外細胞學研究中我們證實該突變為無功能突變，表達突變的細胞影響DNA損傷后的細胞周期和凋亡?；诖?，我們提出假設：CHEK2 Y390C突變可能通過影響乳腺癌細胞周期的改變，進而導致染色體的不穩定性發生。因此，通過建立的CHEK2 Y390C基因敲入小鼠模型，以研究該突變功能驗證階段，通過該模型的建立，我們力圖闡明等位基因CHEK2 Y390C與乳腺癌遺傳易感性的關系，為CHEK2基因與乳腺癌遺傳易感性之間的關系奠定基礎。

本發明采用了如下技術方案：

一種建立乳腺癌易感基因突變動物模型的方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一，構建與人CHEK2 Y390C相對應的位點的相應動物的打靶載體，

步驟二，通過電轉，將打靶載體轉入ES細胞中；

步驟三，篩選正確同源重組的ES克隆，

步驟四，將ES進行囊胚注射，得到嵌合體動物，再經過繁育和純化后獲得可穩定遺傳的Y390C動物模型。

進一步，本發明的建立乳腺癌易感基因突變動物模型的方法，還可以具有這樣的特征：步驟一中，與人CHEK2 Y390C對應的小鼠位點為Y394C。

進一步，本發明的建立乳腺癌易感基因突變動物模型的方法，還可以具有這樣的特征：步驟二中，ES細胞為B6/BLU ES細胞系。

進一步，本發明的建立乳腺癌易感基因突變動物模型的方法，還可 以具有這樣的特征：通過長片段PCR及Southern blot篩選出中靶克隆。

進一步，本發明的建立乳腺癌易感基因突變動物模型的方法，還可以具有這樣的特征：其中，所述長片段PCR的5’端引物是：

CHEK2-5F2:GAGGTCTGTTTCTTACCTGC

ES-1R3:AAGGGTTATTGAATATGATCGGA

所述長片段PCR的3’端引物是：

CHEK2-3R1:TCTGAAGAGATGAATGTGTG

ES-2F4:GCATCGCATTGTCTGAGTAGGTG

進一步，本發明的建立乳腺癌易感基因突變動物模型的方法，還可以具有這樣的特征：步驟四中，囊胚注射后首先選取高嵌合率的嵌合體小鼠。

進一步，本發明的建立乳腺癌易感基因突變動物模型的方法，還可以具有這樣的特征：步驟四中，將嵌合體小鼠與B6小鼠進行繁育，得到的F1代小鼠用PCR測序鑒定基因型。

進一步，本發明的建立乳腺癌易感基因突變動物模型的方法，還可以具有這樣的特征：其特征在于：將KIn的雜合小鼠與全身表達Cre的品系交配，去除Neo得到KI模型；將KI/wt小鼠互配得到純合子小鼠。

本發明還提供上述的純合子小鼠在篩選乳腺癌藥物中的應用。

發明的有益效果

本發明的建立乳腺癌易感基因突變動物模型的方法，由于在小鼠中引入與人CHEK2 Y390C突變對應的Y394C，因此能夠建立一種對CHEK2 Y390C的功能進行研究的模型動物，為乳腺癌易感基因的研究提供便利。

附圖說明

圖1是打靶載體的圖譜；

圖2是打靶載體的XhoI單酶切驗證結果；

圖3是ApaLI單酶切驗證結果；

圖4是5’長片段PCR篩選結果圖之一；