[發明專利]一種恒溫擴增體系中生成單鏈產物的方法

有效

• 申請號: 201710028291.9
• 申請日: 2017-01-16
• 公開（公告）號: CN107058287B
• 公開（公告）日: 2020-06-16
• 發明（設計）人: 王柳;吳堅
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6844
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 劉曉春;何碧珩

本發明提供一種有助于恒溫擴增體系中生成單鏈產物的方法；所述單鏈產物生成方法如下：所述恒溫擴增體系包含有兩對引物，F1、R1和BF、BR，在某些條件下，F1、R1包含三個部分：靠近引物5’端的固定區，靠近3’端的能夠與模板進行特異性結合的識別區及固定區和識別區中間的切口酶區域。本發明反應速率快、成本低、操作簡便，能夠通過恒溫擴增方法生成單鏈DNA擴增產物，克服背景技術中存在的技術缺陷。

技術領域

本發明屬于核酸分析與檢測領域，具體涉及一種恒溫擴增體系中生成單鏈產物的方法。

背景技術

核酸擴增技術在當今的分析檢測領域具有十分重要的意義。食品安全檢測、環境監控、醫療診斷、法醫鑒定等領域無不依賴于核酸擴增技術。最早也是最經典的核酸擴增技術是在耐熱性聚合酶的幫助下，依靠溫度的不斷循環交替而實現模板變性、引物退火及延伸從而實現目標產物的大量積累，這種技術被稱作聚合酶鏈式反應（PCR）。然而，PCR最大的缺陷也就在于，其不斷的溫度變化過程對儀器（PCR儀）提出了相對高的要求，并進而限制了其擴增速率。恒溫擴增的出現徹底擺脫了對精密溫控設備的依賴，僅僅一個熱塊、一臺水浴鍋甚至一只保溫效果良好的保溫瓶、熱水瓶等即可滿足反應需求。常見的恒溫擴增技術包括：環介導等溫擴增（LAMP）、重組聚合酶擴增（RPA）、鏈置換擴增（SDA）、依賴解旋酶的擴增（HDA）等等。然而，這些擴增方法反應時間相對較長，或需要多種酶同時工作而造成檢測成本高，或需要特定的核苷酸參與而造成高成本、低反應速率等問題。因此，十分需要一種反應速率快、成本低、操作簡便的恒溫擴增方法。

核酸擴增的另外一個問題在于產物的快速特異性檢測。基于凝膠電泳的方法雖然能夠根據目標產物的分子量大小而對擴增產物進行較為直觀的分析。但是其對專用凝膠成像設備的依賴及操作的費時費力使其不利于現場快速檢測。基于可視化顯色的鈣黃綠素法、濁度法雖然操作簡便，但無法鑒別非特異性擴增。而實時熒光定量的方法要求反應儀器具有相對精密的光學設備。試紙條檢測方法具有操作簡便、結果易于讀取、特異性強等優點而廣受青睞。但是試紙條檢測的缺點是針對某個特殊的分析目標必須對引物實現抗原-抗體修飾或者對目標核酸分子進行探針捕獲。對于某些反應過程中引物會被切斷的反應，針對引物進行抗原抗體修飾顯然并不可取，因此更好的方法是實現探針捕獲。但是探針捕獲的核酸分子往往是單鏈，對于雙鏈核酸分子，探針捕獲顯然并不方便。因此，本發明的目的是針對恒溫擴增體系提供一種單鏈DNA產物的生成方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種有助于恒溫擴增體系中生成單鏈產物的方法。

所述單鏈產物生成方法如下：

1）所述恒溫擴增體系包含有兩對引物，F1、R1和BF、BR，在某些條件下，F1、R1包含三個部分：靠近引物5’端的固定區，靠近3’端的能夠與模板進行特異性結合的識別區及固定區和識別區中間的切口酶區域。

2）所述恒溫擴增體系需要至少兩種酶的參與：其一為具有鏈取代活性的聚合酶，能夠在引物與模板結合之后在引物的3’端加成核苷酸，使得引物的3’不斷延伸，并取代原來模板鏈的互補鏈。其二為具有能夠特異性識別某些特定核苷酸序列位點，并在具有此特異性核苷酸序列位點的雙鏈DNA中的其中一條單鏈上產生切口的切口酶。

3）所述恒溫擴增體系至少包含一條核酸阻遏物，能夠與所述恒溫擴增體系的其中一條產物進行很強的互補配對，防止在核酸阻遏物的上游的帶有切口酶位點的引物與所述產物結合后被聚合酶延伸為長的產物鏈。

4）所述單鏈產物的生成方法其具體原理（圖1）為：

（ⅰ）在某些反應溫度下，引物F1和BF與同一條模板鏈結合，引物BF在引物F1的上游。

（ⅱ）在聚合酶的作用下，引物F1的3’末端被聚合酶延伸。

（ⅲ）在相同的反應溫度下，引物BF的3’末端被延伸，并取代F1延伸所得的產物S1。