[發明專利]一種恒溫擴增體系中生成單鏈產物的方法

有效

• 申請號: 201710028291.9
• 申請日: 2017-01-16
• 公開（公告）號: CN107058287B
• 公開（公告）日: 2020-06-16
• 發明（設計）人: 王柳;吳堅
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6844
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 劉曉春;何碧珩

1.一種恒溫擴增體系中生成單鏈產物的方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)設計兩對引物，F1、R1和BF、BR，其中F1、R1包含三個部分：靠近引物5’端的固定區，靠近3’端的能夠與模板進行特異性結合的識別區及固定區和識別區中間的切口酶作用區域；

(2)選取反應酶，包括具有鏈取代活性的聚合酶和切口酶，所述聚合酶能夠在引物與模板結合之后在引物的3'端加成核苷酸，使得引物的3'不斷延伸，并取代原來模板鏈的互補鏈；所述切口酶能夠識別特異性的核苷酸序列，并在含有此序列的上游、中間、或者下游的雙鏈DNA的其中一條鏈上產生缺口；

(3)選取核酸阻遏物，該核酸阻遏物能夠與所述恒溫擴增體系的一條產物進行互補配對，防止引物與所述產物結合后被聚合酶被過度延伸；

(4)所述單鏈產物的生成方法具體包括以下步驟：

(ⅰ)在某些反應溫度下，引物F1和BF與同一條模板鏈結合，引物BF在引物F1的上游，

(ⅱ)在聚合酶的作用下，引物F1的3’末端被聚合酶延伸，

(ⅲ)在相同的反應溫度下，引物BF的3'末端被延伸，并取代F1延伸所得的產物S1，

(ⅳ)引物R1和BR與產物S1結合，引物BR在引物R1的上游，

(ⅴ)在聚合酶的作用下，引物R1的3’末端被聚合酶延伸，

(ⅵ)在相同的反應溫度下，引物BR的3'末端被延伸，并取代R1延伸所得的產物P1，

(ⅶ)在相同的反應條件下，引物F1與產物P1結合，并在聚合酶的作用下延伸引物的3’末端，

(ⅷ)切口酶特異性識別雙鏈DNA產物的切口位點，并在雙鏈區的特異性位點的其中一條DNA鏈上產生一缺口，

(ⅸ)在聚合酶的幫助下，具有缺口的DNA鏈3'末端繼續被延伸，并取代原來的切口位點下游的DNA鏈，

當切口酶濃度較低時，生成產物A1，

當切口相對過量時，生成產物E1，

(ⅹ)引物R1的識別區域與產物A1或產物E1結合，并在引物R1的3'末端沿著產物A1或E1進行延伸，

同時，核酸阻遏物與A1或E1結合，

(xi)當延伸至核酸阻遏物的位置時，聚合酶的鏈取代作用不足以取代下強堿基互補配對的核酸阻遏物，引物延伸終止，

(xii)切口酶特異性切割出短的延伸產物，生成單鏈擴增產物；

所述方法生成的單鏈DNA產物的長度為30-60nt；

所述的反應溫度為35-65℃；

所述核酸阻遏物的組成是普通脫氧核糖核酸、核糖核苷酸，或者，帶修飾的核苷酸、不帶修飾的核苷酸，或者肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)；

所述核酸阻遏物的長度優選為14-18nt；

所述核酸阻遏物的濃度為0.05-0.2uM；

所述核酸阻遏物的3’端距離與其互補的產物的5’端的距離為15-22nt；

所述核酸阻遏物的GC含量優選為30％-60％；

所述核酸阻遏物的3'羥基末端采用脫羥基修飾，所述的脫羥基修飾包括生物素化和C3-spacer。