[發(fā)明專利]革蘭氏陽(yáng)性及陰性菌質(zhì)譜檢測(cè)試劑盒及快速鑒定的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710027785.5
• 申請(qǐng)日: 2017-01-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107064286B
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-07-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 屠博文;唐宏兵;杜強(qiáng);黎俊宏;歐陽(yáng)運(yùn)富
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 常州市疾病預(yù)防控制中心
• 主分類號(hào): G01N27/64
• 分類號(hào): G01N27/64;G01N1/28;G01N1/30;G01N1/38;G01N1/42
• 代理公司: 北京律譜知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11457
• 代理人: 黃云鐸

本發(fā)明涉及革蘭氏陽(yáng)性及陰性菌的生物質(zhì)譜檢測(cè)試劑盒及制備方法，屬于微生物快速檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。由標(biāo)準(zhǔn)菌株、標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合物、前處理液、革蘭氏陽(yáng)性菌預(yù)混液、革蘭氏陰性菌預(yù)混液、CHCA基質(zhì)、穩(wěn)定劑等組成，可以實(shí)現(xiàn)革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌分類快速檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)菌株、標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合物、穩(wěn)定劑、預(yù)混液及基質(zhì)等各小管放置于4℃冷藏。本發(fā)明可適用于不同革蘭氏菌的純菌落質(zhì)譜檢測(cè)用試劑盒。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物質(zhì)譜檢測(cè)試劑盒領(lǐng)域，尤其涉及一種應(yīng)用于不同革蘭氏類型單菌落使用不同配比的基質(zhì)液處理結(jié)晶化以便進(jìn)行MALDI-TOF質(zhì)譜檢測(cè)的基質(zhì)液配方及快速鑒定的方法。

背景技術(shù)

微生物體內(nèi)存在大量的高度保守的蛋白和核酸，這些蛋白及核酸具有物種水平上的差異，且可穩(wěn)定遺傳，利用基質(zhì)輔助激光解析飛行質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)可以定量的解析這些蛋白和核酸，通過(guò)標(biāo)記物種特征峰及質(zhì)量圖譜進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。隨著可靠的生物標(biāo)志物不斷涌現(xiàn)，MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)的越加完善。不斷完善的微生物質(zhì)譜因子數(shù)據(jù)庫(kù)以管家基因及特異性蛋白為生物標(biāo)記，大量的研究以標(biāo)識(shí)特異性質(zhì)譜峰為數(shù)據(jù)內(nèi)容，不斷彌補(bǔ)著質(zhì)譜在分辨率和正確率上的不足。

建立穩(wěn)定可靠的MALDI-TOF質(zhì)譜微生物樣品處理方法是微生物快速檢測(cè)技術(shù)的重要環(huán)節(jié)。為了實(shí)現(xiàn)微生物的MALDI-TOF-MS飛行質(zhì)譜檢測(cè)，菌株樣品需要進(jìn)行前處理。微生物的細(xì)胞壁成分及培養(yǎng)方式的巨大差異使得質(zhì)譜分析前處理流程及隨之而來(lái)的基質(zhì)液配比的要求也不同。傳統(tǒng)的預(yù)混基質(zhì)液配方單一，不能區(qū)分革蘭氏染色陰性和陽(yáng)性菌，微生物前處理的差異極大的影響質(zhì)譜檢測(cè)的準(zhǔn)確性。同時(shí)目前的基質(zhì)預(yù)混方法存在缺陷，均不能有效區(qū)分革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌的質(zhì)譜分析特征，商業(yè)化基質(zhì)液無(wú)法長(zhǎng)期保存。這些缺陷都制約著微生物快速鑒定技術(shù)的精準(zhǔn)性和有效性。在進(jìn)行微生物質(zhì)譜的快速鑒定時(shí)還沒(méi)有針對(duì)革蘭氏菌的不同特征進(jìn)行分類處理的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)譜試劑盒及處理方法的技術(shù)報(bào)道。

因此，需要采用一種針對(duì)不同革蘭氏菌的檢測(cè)流程及基質(zhì)液處理方法，含有所有必要試劑，使用簡(jiǎn)單方便。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是克服微生物質(zhì)譜快速鑒定技術(shù)中前處理方法單一的技術(shù)不足，采用一種針對(duì)不同革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌分類處理的質(zhì)譜樣品制備試劑盒及制備方法，該試劑盒及方法為微生物質(zhì)譜快速檢測(cè)樣品優(yōu)化處理提供的新的途徑，為準(zhǔn)確快速的鑒定微生物提供基礎(chǔ)。

一種革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌分類處理的質(zhì)譜樣品制備試劑盒包括以下物質(zhì)：(1)前處理液：取純甲酸、乙酸和水，5-10℃環(huán)境下混合，控制甲酸濃度20-30％(v/v)而乙酸0-10％(v/v)，隨后加入0.2-0.5mM的硫脲；

(2)革蘭氏陽(yáng)性菌預(yù)混液：先將乙醇、乙腈、水常溫混合，三者配比為1∶1∶1，使用時(shí)預(yù)先加入1.0-1.5％的基質(zhì)，基質(zhì)是α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)、二羥基苯甲酸、芥子酸中的任何一種，迅速振蕩攪拌，待粉末溶解完全后靜置10分鐘，1000rpm離心1分鐘，管底出現(xiàn)少量黃色沉淀則表示過(guò)飽和溶液配置成功，-20℃保存；

(3)革蘭氏陰性菌預(yù)混液：先將乙醇、乙腈、水常溫混合，三者配比為1∶1.5∶1，加入0.5mM的硫脲，使用時(shí)預(yù)先加入2.0-2.5％的基質(zhì)，迅速振蕩攪拌完全，加入10％的穩(wěn)定劑，繼續(xù)振蕩攪拌30秒，待粉末溶解完全后靜置10分鐘，1000rpm離心1分鐘。-20℃保存；

(4)陽(yáng)性基質(zhì)、陰性基質(zhì)

(5)菌落緩沖液：0.1M的PBS或NaAC，pH值6.5～7.2；

(6)標(biāo)準(zhǔn)菌株：ATCC8739大腸埃希菌株干粉，由BSA溶液與純菌落混合后經(jīng)過(guò)冷凍干燥而得；

(7)標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合物：由ATCC25923金黃色葡萄球菌，經(jīng)過(guò)由5M尿素，2M硫脲，1.0％3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽(CHAPs)及0.5M Tris-Hcl組成的裂解液處理1分鐘后，13000rpm離心15分鐘，去除沉淀后獲得的蛋白混合物；