[發明專利]革蘭氏陽性及陰性菌質譜檢測試劑盒及快速鑒定的方法

有效

• 申請號: 201710027785.5
• 申請日: 2017-01-16
• 公開（公告）號: CN107064286B
• 公開（公告）日: 2018-07-20
• 發明（設計）人: 屠博文;唐宏兵;杜強;黎俊宏;歐陽運富
• 申請（專利權）人: 常州市疾病預防控制中心
• 主分類號: G01N27/64
• 分類號: G01N27/64;G01N1/28;G01N1/30;G01N1/38;G01N1/42
• 代理公司: 北京律譜知識產權代理事務所(普通合伙) 11457
• 代理人: 黃云鐸

1.一種革蘭氏陽性和陰性菌分類處理的質譜樣品制備試劑盒，該試劑盒包括以下物質：

(1)前處理液：取純甲酸、乙酸和水，5-10℃環境下混合，控制甲酸濃度20-30％(v/v)而乙酸0-10％(v/v)，隨后加入0.2-0.5mM的硫脲；

(2)革蘭氏陽性菌預混液：將乙醇、乙腈和水常溫混合，三者配比為1：1：1，制備成為革蘭氏陽性菌預混液；

(3)革蘭氏陰性菌預混液：先將乙醇、乙腈、水常溫混合，三者配比為1：1.5：1，加入0.5mM的硫脲，制備成為革蘭氏陰性菌預混液；

(4)陽性基質、陰性基質；

(5)菌落緩沖液：0.1M的PBS或NaAC，pH值6.5～7.2；

(6)標準菌株：ATCC8739大腸埃希菌株干粉，由BSA溶液與純菌落混合后經過冷凍干燥而得；

(7)標準蛋白混合物：由ATCC25923金黃色葡萄球菌，經過由5M尿素，2M硫脲，1.0％3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內鹽(CHAPs)及0.5M Tris-HCl組成的裂解液處理1分鐘后，13000rpm離心15分鐘，去除沉淀后獲得的蛋白混合物；

(8)穩定劑：2～5％的三氟乙酸母液；

(9)革蘭氏染色液：包括結晶紫溶液、碘酒、番紅溶液、95％乙醇和水。

2.如權利要求1所述的質譜樣品制備試劑盒，其中所述陽性基質是α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)、二羥基苯甲酸、芥子酸中的任何一種。

3.如權利要求1所述的質譜樣品制備試劑盒，其中所述陰性基質是α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)。

4.一種通過采用如權利要求1所述的質譜樣品制備試劑盒的快速鑒定方法，其包括以下步驟：

(1)待測菌落使用所述革蘭氏染色液進行革蘭氏染色以判別革蘭氏陽性或陰性菌；

(2)將革蘭氏陽性菌預混液或陰性菌預混液與基質混合配置而成基質液，革蘭氏陰性基質液是在所述革蘭氏陰性菌預混液加入2.0-2.5％的所述陰性基質，迅速振蕩攪拌完全，加入10％的穩定劑，繼續振蕩攪拌30秒，待粉末溶解完全后靜置10分鐘，1000rpm離心1分鐘；革蘭氏陽性基質液是在所述革蘭氏陽性菌預混液加入1.0-1.5％的所述陽性基質，迅速振蕩攪拌，待粉末溶解完全后靜置10分鐘，1000rpm離心1分鐘，管底出現少量黃色沉淀則表示過飽和溶液配置成功，兩種所述基質液都短期使用置于4℃環境下，或一周內用完則置于-20℃環境下；

(3)取新鮮培養的革蘭氏陽性或陰性菌單菌落，使用所述菌落緩沖液配置成麥氏濁度的菌懸液，其中革蘭氏陰性菌3.0～3.5MCF或者革蘭氏陽性菌2.0～2.5MCF，取100μL置于0.5ml離心管中，充分振蕩后13000rpm離心5分鐘，除去上清后備用；

(4)革蘭氏陽性菌需要加入20μL的所述前處理液，隨后充分振蕩，室溫下靜置10分鐘，隨后打開管蓋，在潔凈臺內通風5分鐘；

(5)加入現配的革蘭氏陽性或陰性基質液20μL，制備成待測含菌的基質液混合物，充分振蕩后在對應靶板上加入含菌樣品的革蘭氏陽性或陰性基質液混合物1～1.5μL，室溫下通風干燥10分鐘，待結晶化完全后可進行質譜鑒定；

(6)對應菌株樣品及標準菌株均需要經過上述處理，革蘭氏陽性菌選用標準蛋白混合物作為參照，革蘭氏陰性菌則選用ATCC8739標準菌株作為參照；使用參照可以定期校正質譜的精準性，以減少鑒定誤差；

(7)進一步的微生物質譜鑒定，需要配合對應儀器的微生物質譜數據庫對比分析。

5.根據權利要求4所述的快速鑒定方法，其中所述革蘭氏染色包括：首先涂片后進行結晶紫染色1分鐘，水洗后加入碘酒染色1分鐘，再次水洗后加入95％乙醇洗脫30秒，進一步水洗后加入番紅溶液復染1分鐘，最后水洗進行顯微鏡觀察，結果根據革蘭氏染色法進行判別。

6.根據權利要求5所述的快速鑒定方法，其中所述新鮮培養的革蘭氏陽性或陰性菌單菌落使用普通大豆瓊脂平板或血瓊脂平板。