[發(fā)明專利]一種高比活內(nèi)切木聚糖酶NPWXynB及其基因和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710027083.7
• 申請日: 2017-01-15
• 公開（公告）號: CN106834255B
• 公開（公告）日: 2019-12-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李陽源;王建榮;周銀華;夏雨;楊玲
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東溢多利生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 11318 北京法思騰知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 高宇

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種高比活突變內(nèi)切木聚糖酶NPWXynB及其基因和應(yīng)用。通過定向進化及定點突變技術(shù)對來源于瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum的內(nèi)切木聚糖酶XynB進行分子改造得到高比活木聚糖酶NPWXynB。其氨基酸序列中的第58位用F替代Y，第78位用Y替代M，第94位用S替代Y，第143位用L替代V，第145位用R替代E，第182位用R替代D。本發(fā)明提供的內(nèi)切木聚糖酶突變體NPWXynB在37℃條件下的比活為11500U/mg，比原始內(nèi)切木聚糖酶XynB的比活提高82.5％。本發(fā)明構(gòu)建的含NPWXynB基因的重組工程菌最大酶活可達153000U/mL，極大的降低了生產(chǎn)成本。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種高比活突變內(nèi)切木聚糖酶NPWXynB及其基因和應(yīng)用。

背景技術(shù)

木聚糖作為一種五碳糖，是半纖維素的重要組成部分，廣泛的存在于自然界。木聚糖幾乎占地球上可更新有機碳含量的三分之一，是僅次于纖維素的第二豐富的多聚糖。木聚糖在裸子植物中占干物質(zhì)重量的7％-12％，在被子植物中占干物質(zhì)重量的15％-30％，同時木聚糖也廣泛存在于飼料原料中如小麥、玉米等。木聚糖作為一種非淀粉多糖具有很強的抗營養(yǎng)作用，主要表現(xiàn)為：單胃動物難以消化吸收木聚糖；木聚糖可結(jié)合大量的水，增加動物消化道內(nèi)食糜的體積和粘度從而阻礙營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，降低了飼料的利用率。

木聚糖酶是指能夠?qū)⒛揪厶墙到鉃榈途勰咎呛湍咎沁@一類酶的總稱，主要包括內(nèi)切β-1,4木聚糖酶、木糖苷酶、阿拉伯糖苷酶等，其中內(nèi)切β-1,4木聚糖酶在這一類酶中發(fā)揮主要作用。來源于瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum的內(nèi)切木聚糖酶XynB由于其良好的酶學特性，使其在飼料、造紙等行業(yè)具有很大的應(yīng)用潛力。為了使瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum內(nèi)切木聚糖酶XynB廣泛應(yīng)用到眾多工業(yè)領(lǐng)域中，提高其比活力及表達水平，降低生產(chǎn)成本是急需解決的問題。本發(fā)明通過結(jié)合定向進化和定點突變技術(shù)，提高了瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum內(nèi)切木聚糖酶XynB的比活力，大大降低了其生產(chǎn)成本，為其進一步工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是通過對來源于瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum的內(nèi)切木聚糖酶XynB進行分子改造，使改造后的內(nèi)切木聚糖酶具有更高的比活，降低生產(chǎn)成本，符合工業(yè)化大生產(chǎn)的要求。

本發(fā)明的目的是提供一種高比活的突變內(nèi)切木聚糖酶NPWXynB及其基因。

本發(fā)明的再一目的是提供包含上述的高比活突變內(nèi)切木聚糖酶基因的重組載體。

本發(fā)明的再一目的是提供包含上述的高比活突變內(nèi)切木聚糖酶基因的重組菌株。

本發(fā)明的再一目的是提供一種表達突變高比活內(nèi)切木聚糖酶NPWXynB的方法。Neocallimastix patriciarum內(nèi)切木聚糖酶XynB的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

本發(fā)明采用易錯PCR及定點飽和突變的方法對SEQ ID NO.1所示的內(nèi)切木聚糖酶XynB進行分子改造，經(jīng)過高通量篩選得到高比活內(nèi)切木聚糖酶NPWXynB，本發(fā)明的高比活內(nèi)切木聚糖酶NPWXynB和原有的Neocallimastix patriciarum內(nèi)切木聚糖酶XynB相比，有5個氨基酸的差異，突變位點由+78M,+94Y,+143V,+145E,+182D,突變成+78Y,+94S,+143L,+145R,+182R,突變后的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

本發(fā)明還提供了上述高比活內(nèi)切木聚糖酶NPWXynB的基因序列，其堿基序列如SEQID NO.3所示：