[發明專利]一種高比活內切木聚糖酶NPWXynB及其基因和應用

有效

• 申請號: 201710027083.7
• 申請日: 2017-01-15
• 公開（公告）號: CN106834255B
• 公開（公告）日: 2019-12-10
• 發明（設計）人: 李陽源;王建榮;周銀華;夏雨;楊玲
• 申請（專利權）人: 廣東溢多利生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 11318 北京法思騰知識產權代理有限公司
• 代理人: 高宇

本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種高比活突變內切木聚糖酶NPWXynB及其基因和應用。通過定向進化及定點突變技術對來源于瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum的內切木聚糖酶XynB進行分子改造得到高比活木聚糖酶NPWXynB。其氨基酸序列中的第58位用F替代Y，第78位用Y替代M，第94位用S替代Y，第143位用L替代V，第145位用R替代E，第182位用R替代D。本發明提供的內切木聚糖酶突變體NPWXynB在37℃條件下的比活為11500U/mg，比原始內切木聚糖酶XynB的比活提高82.5％。本發明構建的含NPWXynB基因的重組工程菌最大酶活可達153000U/mL，極大的降低了生產成本。

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種高比活突變內切木聚糖酶NPWXynB及其基因和應用。

背景技術

木聚糖作為一種五碳糖，是半纖維素的重要組成部分，廣泛的存在于自然界。木聚糖幾乎占地球上可更新有機碳含量的三分之一，是僅次于纖維素的第二豐富的多聚糖。木聚糖在裸子植物中占干物質重量的7％-12％，在被子植物中占干物質重量的15％-30％，同時木聚糖也廣泛存在于飼料原料中如小麥、玉米等。木聚糖作為一種非淀粉多糖具有很強的抗營養作用，主要表現為：單胃動物難以消化吸收木聚糖；木聚糖可結合大量的水，增加動物消化道內食糜的體積和粘度從而阻礙營養物質的消化和吸收，降低了飼料的利用率。

木聚糖酶是指能夠將木聚糖降解為低聚木糖和木糖這一類酶的總稱，主要包括內切β-1,4木聚糖酶、木糖苷酶、阿拉伯糖苷酶等，其中內切β-1,4木聚糖酶在這一類酶中發揮主要作用。來源于瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum的內切木聚糖酶XynB由于其良好的酶學特性，使其在飼料、造紙等行業具有很大的應用潛力。為了使瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum內切木聚糖酶XynB廣泛應用到眾多工業領域中，提高其比活力及表達水平，降低生產成本是急需解決的問題。本發明通過結合定向進化和定點突變技術，提高了瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum內切木聚糖酶XynB的比活力，大大降低了其生產成本，為其進一步工業化應用奠定基礎。

發明內容

本發明的目的是通過對來源于瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum的內切木聚糖酶XynB進行分子改造，使改造后的內切木聚糖酶具有更高的比活，降低生產成本，符合工業化大生產的要求。

本發明的目的是提供一種高比活的突變內切木聚糖酶NPWXynB及其基因。

本發明的再一目的是提供包含上述的高比活突變內切木聚糖酶基因的重組載體。

本發明的再一目的是提供包含上述的高比活突變內切木聚糖酶基因的重組菌株。

本發明的再一目的是提供一種表達突變高比活內切木聚糖酶NPWXynB的方法。Neocallimastix patriciarum內切木聚糖酶XynB的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

本發明采用易錯PCR及定點飽和突變的方法對SEQ ID NO.1所示的內切木聚糖酶XynB進行分子改造，經過高通量篩選得到高比活內切木聚糖酶NPWXynB，本發明的高比活內切木聚糖酶NPWXynB和原有的Neocallimastix patriciarum內切木聚糖酶XynB相比，有5個氨基酸的差異，突變位點由+78M,+94Y,+143V,+145E,+182D,突變成+78Y,+94S,+143L,+145R,+182R,突變后的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

本發明還提供了上述高比活內切木聚糖酶NPWXynB的基因序列，其堿基序列如SEQID NO.3所示：