[發(fā)明專利]一種棕色棉纖維原花青素轉運相關的GST蛋白基因及其應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710025912.8
• 申請日: 2017-01-13
• 公開（公告）號: CN106754999A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發(fā)明（設計）人: 高俊山;許磊;陳文;孟艷;蔡永萍;林毅
• 申請（專利權）人: 安徽農業(yè)大學
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N15/82;C12N1/21;C12N9/10;A01H5/00
• 代理公司: 安徽匯樸律師事務所34116
• 代理人: 洪玲

技術領域

本發(fā)明涉及的是植物分子生物學的技術領域，尤其涉及的是一種棕色棉GhTT19基因及其應用。

背景技術

棉花是錦葵科棉屬植物，它既是重要的纖維作物，又是重要的油料作物，還是紡織、精細化工原料和重要的戰(zhàn)略物資。棕色棉是一種纖維呈現(xiàn)天然棕色的彩色棉,由于其本身帶有天然的顏色,在棉花紡織生產過程中,可以免去漂白、消毒、染色等過程,污染少、環(huán)保健康。隨著環(huán)保理念深入人心，棕色棉迎合了市場的需求，具有廣闊的市場前景。

但是,棕色棉與白色棉相比，其品質不夠理想,存在纖維顏色單一、著色不均勻、色牢度和色飽和度低等問題，嚴重制約了棕色棉的生產與應用。因此，必須解析棕色棉纖維色素合成的分子機理，為培育纖維色素穩(wěn)定的棕色棉新品種奠定基礎，同時能增加棉農收入和滿足國民經濟發(fā)展多方面的需要。前人從棕色棉纖維中克隆了原花色素合途徑中的結構基因(F3H,DFR,CHI等),結合棕色棉纖維色素化學性質的鑒定結果,初步推斷棕色棉纖維色素的合成前體為縮合單寧,即原花色素(proanthocyanidins，PA)。

TRANSPARENT TESTA19是一種參與原花青素、花青素轉運的游離蛋白，歸屬于GST家族。擬南芥TT19基因(AtTT19)編碼一種類黃酮代謝途徑必需的GST家族的Phi類轉運蛋白，其生物學功能是將胞漿內合成的花青素、原花青素等多酚類色素的單體物轉運到液泡等亞細胞器官中，然后花青素在酸性條件下顯色或原花青素進一步聚合后形成有色色素。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足，提供了一種棕色棉纖維原花青素轉運相關的GST蛋白基因及其應用，以提供一種新的與色素轉運相關的棉花基因，為培育纖維色素穩(wěn)定的棕色棉新品種奠定基礎。

本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的：

本發(fā)明提供了一種棕色棉纖維原花青素轉運相關的GST蛋白基因，所述基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，命名為GhTT19，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明還提供了上述棕色棉纖維原花青素轉運相關的GST蛋白基因在培育棕色棉新品種中的應用。

本發(fā)明還提供了一種植物表達載體，所述植物表達載體含有上述棕色棉纖維原花青素轉運相關的GST蛋白基因。

進一步地，所述植物表達載體為含有上述基因的pCambia1301a載體。

本發(fā)明還提供了一種遺傳工程化的宿主細胞，所述宿主細胞含有上述植物表達載體，或其基因組中整合有外源的所述棕色棉纖維原花青素轉運相關的GST蛋白基因。

進一步地，所述宿主細胞為含有上述植物表達載體或整合有所述基因的農桿菌細胞。

本發(fā)明還提供了一種制備轉基因植物的方法，所述植物為擬南芥，所述方法包括以下步驟：

(1)制備侵染液：將所述宿主細胞活化后，用緩沖液重懸，獲得侵染液，所述緩沖液為含有質量比為5％的蔗糖和0.02％的Silwet L-77的1/2MS液體培養(yǎng)基，所述侵染液的OD₆₀₀值為0.8；

(2)將預轉化的擬南芥苗的果莢和已開放的花朵全部剪掉，只留花蕾，將全部花蕾倒置浸在步驟(1)的侵染液中45s，再置于黑暗處培養(yǎng)一天，然后置于光照培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，并控制光照時間為16h/天；

(3)每隔1周重復步驟(2)一次，直至種子成熟，獲得T0代種子；

(4)將T0代種子消毒后接種指含有50mg/L潮霉素的MS固體篩選培養(yǎng)基中，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并控制光照時間為16h/天，至幼苗長出4-6片蓮座后，移入營養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng)并收獲T1代種子，只有含有所述植物表達載體的種子能夠在含有50mg/L潮霉素的MS固體篩選培養(yǎng)基中生長，由此可篩選出陽性植株；

(5)重復步驟(4)獲得穩(wěn)定遺傳的轉基因植株及其后代。

本發(fā)明相比現(xiàn)有技術具有以下優(yōu)點：本發(fā)明提供了一種棕色棉纖維原花青素轉運相關的GST蛋白基因及其應用，通過對該基因編碼序列的分析和遺傳轉化擬南芥，結果表明，該基因能夠控制纖維色素的形成，提高植物色澤，為利用基因工程技術對棕色棉色彩性狀進行遺傳改良提供了參考依據，為培育纖維色素穩(wěn)定的棕色棉新品種提供了新的途徑。

附圖說明

圖1為pCambia1301a-GhTT19載體構建圖譜；

圖2為擬南芥陽性苗PCR驗證結果圖；

圖3為轉GhTT19基因擬南芥T₂代植株組織化學染色結果圖；