[發明專利]一種牛支原體Taqman熒光PCR試劑盒及其使用方法

在審

• 申請號: 201710025722.6
• 申請日: 2017-01-13
• 公開（公告）號: CN106701959A
• 公開（公告）日: 2017-05-24
• 發明（設計）人: 程振濤;袁海文;李濤;文明;周碧君;王開功;岳筠
• 申請（專利權）人: 貴州大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 貴陽中新專利商標事務所52100
• 代理人: 吳無懼

技術領域

本發明屬于動物醫學領域中牛支原體病的檢測，特別涉及一種用于檢測牛支原體病原的實時熒光定量檢測試劑盒及其專用引物、探針與其在檢測牛支原體中的應用。

背景技術

牛支原體一種能引起犢牛肺炎，成年牛乳腺炎的重要的病原微生物。1961年，美國科學家hale首次從患有乳腺炎的牛乳中分離到了牛支原體。對牛支原體的研究越來越深入。牛支原體屬于柔膜體綱，支原體目，支原體屬，無乳支原體，牛支原體亞種。除了能引起上述的肺炎和乳腺炎以外。在患有耳炎，關節炎，結膜角膜炎，生殖道炎癥及不孕不育癥等的病牛樣本中均曾分離到牛支原體。每年在歐美地區由牛支原體引起的奶牛乳腺炎，犢牛肺炎等癥狀對養牛業造成的損失巨大。隨著優質的外國種牛引進國內，在我國的湖北，重慶，內蒙等地區相繼爆發了由牛支原體引起的相關疾病。發病率高達50％，某些地區病死率更是達到了100％。然而，國內缺乏相關研究延誤對本病的診斷及治療。從而引發了本病的進一步擴大及傳播。目前，對牛支原體的檢測有三種方法，血清學診斷，病原學診斷。

牛支原體的病原學診斷是實驗室中的最為常用的診斷方法。通過對病牛樣品中的總DNA提取，目的基因的PCR擴增及凝膠電泳從而診斷病原微生物。該方法較傳統的培養法而言，周期短，特異性強。然而牛支原體屬于無乳支原體牛亞種，它的DNA序列與牛乳支原體的相似性達到了98％。這不僅影響牛支原體PCR診斷方法的建立，更是對牛支原體血清學診斷產生了巨大的障礙。由于牛支原體與無乳支原體大量的膜蛋白相似，導致血清學的診斷方法的特異性低。

探針法(Taqman)指的是水解寡核苷酸探針。這種方法使用了具有5’外切核酸酶活性的聚合酶。該探針在5’端標記報告熒光基團，在3’端標記淬滅基團，在探針完整時報告熒光基團發出的熒光被淬滅基團吸收，因此沒有熒光產生。在延伸階段，由于DNA聚合具有5’-3’外切酶活性，5’端標記報告熒光基團被水解掉，遠離淬滅基團，于是產生熒光信號。如果在過程中，底物序列不能同探針互補，則探針仍然是游離的，未雜交的探針仍然保持完整，熒光信號也就不能被檢測到。相反，如果正確的底物被擴增出來后，探針就會在復性階段與其雜交，當聚合延伸到探針時，它就會將探針的5’端給替換下來，并將報告基團切割下來，這就使得報告基團和淬滅子分開，從而使熒光信號釋放出來，可通過檢測系統觀察到信號的變化。Taqman探針的優點是可以利用多種熒光同時進行多重分析，這是等結合熒光基團所不具備的優點。

TU基因的功能是編碼主要負責肽鏈延伸的延伸因子tuf。而肽鏈延伸是蛋白質合成的重要步驟。TU基因具有功能保守，其遺傳穩定性及廣泛分布性，使其成為遺傳進化分子標靶重要基因。實驗表明，Tuf基因比16sRNA基因更適合作為分子標靶。熒光定量PCR具有快速、穩定、靈敏等特點。在實驗室及臨床診斷，熒光定量PCR被廣泛運用。該實驗通過建立熒光定量Taqman探針法，為實驗室及臨床診斷提供依據。

發明內容

本發明要解決的技術問題是：提供一種牛支原體Taqman熒光PCR試劑盒及其使用方法，已解決現有技術的不足。

本發明的技術方案是：一種牛支原體Taqman熒光PCR試劑盒，包含TaqMan探針，PCR檢測引物或該引物的衍生序列，PCR擴增試劑，陽性對照和陰性對照,

所述引物的衍生序列，是指在上述序列的基礎上經過一至十個堿基的取代、缺失或添加得到的引物序列。其TaqMan探針是根據衍生序列、牛支原體目的基因序列自行設計合成，具有特異性、唯一性。

所述PCR擴增試劑為pfu DNA擴增酶、dNTPs和緩沖液，均為經經試驗比較后的最佳配比濃度。

所述陽性對照為牛支原體標準株基因組或攜帶牛支原體基因的克隆質粒，優選為pMD19-T-TU；所述陰性對照為不含牛支原體基因的pMD19-T空載體質粒。

所述試劑盒包括實時熒光定量反應條件為94℃預變性3min，94℃變性10S，60℃退火30S，共40個循環。

所述的一種牛支原體Taqman熒光PCR試劑盒使用方法，包含以下步驟：

[1]待檢樣本PCR模板的制備方法：

(1)取支原體培養物、組織勻漿液或鼻腔拭子浸液100μL，按照DNA提取試劑盒提取總DNA備用；

[2]牛支原體Taqman熒光PCR試劑盒反應體系組裝：

(1)取酶混合物12.5μL，上下游引物引物各1μL,探針1μL；

(2)加入已制備好DNA模板2μL，用滅菌雙蒸水補至25μL；

[3]PCR擴增參數為：