[發(fā)明專利]一種牛支原體Taqman熒光PCR試劑盒及其使用方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710025722.6
• 申請(qǐng)日: 2017-01-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106701959A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-05-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 程振濤;袁海文;李濤;文明;周碧君;王開(kāi)功;岳筠
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 貴州大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 貴陽(yáng)中新專利商標(biāo)事務(wù)所52100
• 代理人: 吳無(wú)懼

1.一種牛支原體Taqman熒光PCR試劑盒，其特征在于：包含TaqMan探針，PCR檢測(cè)引物或該引物的衍生序列，PCR擴(kuò)增試劑，陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照,

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種牛支原體Taqman熒光PCR試劑盒，其特征在于：所述引物的衍生序列，是指在上述序列的基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)一至十個(gè)堿基的取代、缺失或添加得到的引物序列。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種牛支原體Taqman熒光PCR試劑盒，其特征在于：所述PCR擴(kuò)增試劑為pfu DNA擴(kuò)增酶、dNTPs和緩沖液。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種牛支原體Taqman熒光PCR試劑盒，其特征在于：所述陽(yáng)性對(duì)照為牛支原體標(biāo)準(zhǔn)株基因組或攜帶牛支原體基因的克隆質(zhì)粒，優(yōu)選為pMD19-T-TU；所述陰性對(duì)照為不含牛支原體基因的pMD19-T空載體質(zhì)粒。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種牛支原體Taqman熒光PCR試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3min，94℃變性10S，60℃退火30S，共40個(gè)循環(huán)。

6.如權(quán)利要求1-5之一所述的一種牛支原體Taqman熒光PCR試劑盒使用方法，其特征在于：

[1]待檢樣本PCR模板的制備方法：

(1)取支原體培養(yǎng)物、組織勻漿液或鼻腔拭子浸液100μL，按照DNA提取試劑盒提取總DNA備用；

[2]牛支原體Taqman熒光PCR試劑盒反應(yīng)體系組裝：

(1)取酶混合物12.5μL，上下游引物引物各1μL,探針1μL；

(2)加入已制備好DNA模板2μL，用滅菌雙蒸水補(bǔ)至25μL；

[3]PCR擴(kuò)增參數(shù)為：

(1)94℃預(yù)變性5min；

(2)94℃10s,60℃31s；循環(huán)數(shù)40，每個(gè)循環(huán)結(jié)束檢測(cè)熒光值；

[4]檢測(cè)結(jié)果判定:

陽(yáng)性對(duì)照Ct值小于20，陰性對(duì)照無(wú)Ct值，說(shuō)明試劑盒、操作過(guò)程均正常，實(shí)驗(yàn)成立；待檢樣本Ct值小于30，判為牛支原體核酸陽(yáng)性；待檢樣本Ct值大于30，牛支原體核酸陰性。