[發明專利]一種滋養細胞刺激NK細胞擴增的方法和用途

在審

• 申請號: 201710025596.4
• 申請日: 2017-01-13
• 公開（公告）號: CN108300697A
• 公開（公告）日: 2018-07-20
• 發明（設計）人: 黃飛;何鳳;趙曉楠;金濤;王海鷹;史子嘯
• 申請（專利權）人: 上海恒潤達生生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;A61K35/17;A61P35/00
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• 代理人: 暫無信息

本發明屬于生物技術領域。本發明公開了表達CD64、CD86、41BBL和mbIL?21滋養細胞(K562?APC3?mbIL21)的構建方法和序列信息。同時也公開了此滋養細胞刺激NK細胞擴增的整個流程和應用的領域。本發明制備的滋養細胞能夠提高NK細胞的體外擴增效率同時也能使NK細胞保持高純度的狀態。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及基因工程改造的滋養細胞來刺激NK細胞的擴增方法和用途。

背景技術

NK(Natural Killer)細胞-自然殺傷細胞，屬于非特異性免疫細胞，表面的標志主要有CD56、CD16等。健康人外周血中，約占淋巴細胞總數的5～15％。為機體抵抗腫瘤的第一道防線，通常處于休眠狀態，信號因子激活后，會滲透到組織中攻擊腫瘤細胞和病毒感染細胞。

NK細胞活性與與腫瘤發病呈負相關性。NK細胞活性隨著年齡的增加逐漸降低，癌癥發病率隨著年齡的增長而增高；NK活性低的人群組要比NK活性中、高組的癌癥發病率高兩倍；癌癥患者體內NK細胞表現為激活性受體(KAR)表達降低，抑制性受體(KIR)表達增加，從而功能受到抑制；癌癥轉移病人的NK活性明顯降低。

NK細胞具有較廣的抗瘤譜。可殺傷同系、同種或異種腫瘤細胞，其殺傷靶細胞的機制可能是1)釋放穿孔素和顆粒酶引起靶細胞壞死或凋亡；2)通過死亡受體調節誘導靶細胞凋亡；3)分泌多種效應性細胞因子對抗轉移腫瘤；4)激發繼發腫瘤免疫反應。

NK細胞是固有免疫系統中淋巴細胞，它不能識別外源抗原分子，但是能夠殺傷腫瘤細胞及病毒感染的細胞[Front Immunol,2014,17,5:95.]。對腫瘤病人進行過繼NK細胞治療有很大前景。因為NK細胞具有很高的殺傷活性且不會產生移植物抗宿主反應。唯一的遺憾是沒有足夠的NK細胞用于免疫治療[Tumors Front Immunol,2014,5:87.]。所以體外擴增NK細胞技術就應運而生，逐步開始發展[Blood,2005,106(1):376-383.]。研究發現，綜合使用各種細胞因子或許在體外、體內有助于NK的增殖及效應功能[Cytokine,2013,62(1):58-63.]。γ鏈細胞因子在NK細胞增殖及功能發揮上均發揮了重要作用。該家族成員包括IL2、IL4、IL7、IL9、IL15和IL21。在NK細胞分化過程中，不同的細胞因子都具有不同的作用[J Biomed Biotechnol,2011,2011:861920.]。

自然殺傷(NK)細胞可以通過增殖細胞因子(例如IL-2和IL-15)激活后擴增。NK細胞通過來自飼養細胞(腫瘤細胞系和PBMC)分泌的一些蛋白質擴增能力大大增強。因此，輻照的飼養細胞和NK細胞的共培養系統的培養基包含IL-2和IL-15，此共培養系統已被開發以產生大量的NK細胞。常用的飼養細胞系是RPMI8866，Epstein-Barr淋巴樣細胞系(EBV-LCL)和K562。已知NK-敏感K562細胞(基因工程修飾后的細胞)的刺激增加NK細胞對IL-2，IL-15和IL-21的組合培養系統增殖反應能力(Methods Mol Biol.2016；1441:167-74.)。IL21是NK細胞功能的重要調節分子，能夠促進NK細胞增殖，增強NK細胞毒性作用及ADCC作用[Nature,2000,408(6808):57-63.]。近年來，有人采用基因工程的方法在K562細胞上同時表達IL-15、CD137L等分子，并以此細胞來刺激NK細胞的增殖。IL-15和CD137L聯合刺激是PBMC中NK細胞特異性擴增的基礎：作為膜蛋白，通過細胞間的接觸刺激，用以誘導NK細胞擴增。IL15能夠促進NK細胞的分化成熟，而IL21能夠聯合IL15分子促進NK細胞的分化成熟[Nature.408(6808):57-63.]

NK細胞在外周血淋巴細胞中所占的比例較低，所以有必要建立一種NK細胞體外擴增技術，用于研究NK細胞的功能，并為腫瘤細胞免疫治療奠定基礎。