[發明專利]利用通用TaqMan探針檢測SNP的方法和試劑盒

有效

• 申請號: 201710025277.3
• 申請日: 2017-01-13
• 公開（公告）號: CN106868111B
• 公開（公告）日: 2020-12-25
• 發明（設計）人: 翟晨光;趙麗娜;盧洪
• 申請（專利權）人: 中玉金標記（北京）生物技術股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 北京卓孚律師事務所 11821
• 代理人: 謝夢欣;任宇

本發明涉及利用通用TaqMan探針檢測SNP的方法和試劑盒。尤其是涉及包含由在5’末端和3’末端分別具有報告熒光團和淬滅基團的通用寡核苷酸序列構成的通用TaqMan探針，和由通用尾部序列(Tail)部分和等位基因特異性序列部分構成的引物的試劑盒，以及利用所述試劑盒檢測SNP的方法。

技術領域

本發明涉及利用通用TaqMan探針檢測SNP的方法和試劑盒。尤其是涉及包含由在5’末端和3’末端分別具有報告熒光團和淬滅基團的通用寡核苷酸序列構成的通用TaqMan探針，和由通用尾部序列(Tail)部分和等位基因特異性序列部分構成的引物的試劑盒，以及利用所述試劑盒檢測SNP的方法。

背景技術

目前常用于檢測PCR產物，尤其是單核苷酸多態性(SNP)的方法主要涉及：

(1)探針法(U.S.專利號：5,538,848)(CAST-PCR“Competitiveallele-specific TaqMan PCR”)，該方法通過在擴增反應中雜交和切割雙標記的發熒光的探針來檢測特異性PCR產物。需要設計一個或者兩個引物，這樣的引物在序列改變的位點退火能夠區分相同基因的不同等位基因。發熒光的探針由用熒光報告染料和淬滅染料標記的寡核苷酸構成。PCR過程中，該TaqMan探針如果雜交到含有SNP的片段，該探針被DNA聚合酶的5’-外切酶活性切割，產生報告染料熒光強度的增加。TaqMan探針的供體和淬滅基團優選位于探針3’-和5’-末端，因為熒光團和淬滅基團之間的5’-3’水解只有在熒光團和淬滅基團不是彼此接近時才發生；

(2)分子信標法(molecular beacon)，該方法也是利用熒光相互作用檢測和定量PCR產物，每個探針都具有5’熒光標記的末端和3’淬滅劑標記的末端(美國專利5,925,517和Tyagi和Kramer等人，Nature Biotech，14:303-309(1996))。而且，分子信標探針還包括大約5-7個堿基的短末端區段，彼此互補并且在溶液中結合在一起形成莖環結構，淬滅劑和熒光標記的末端接近，信號得以抑制；

(3)探針法，該方法也提供了莖環檢測系統，與分子信標類似，除了探針也具有作為擴增引物的連接的區段(Whitcombe等，(1999)Nat.Biotechnol.17:804-807；U.S.Pat.No.6,326,145)。這些探針在未雜交狀態保持莖環構象，熒光淬滅。在退火后再次發生變性，探針區段與模板結合，從而打開莖環結構并且釋放熒光；

(4)探針法，與探針類似，探針包括與發夾探針連接的引物在擴增期間延伸，從而將內部淬滅標記物與5’-末端熒光團分離開(Nazarenko等，Nucleic Acids Research，25:2516-2521)；

(5)ARMS(擴增阻礙突變系統)，該系統包括PCR引物和診斷引物，其基本原理是，如果引物的3′端堿基與模板堿基不互補，則用一般耐熱DNA聚合酶無法延伸。因此根據已知點突變設計3條引物(見引物設計)，其3′端堿基分別與突變和正常的模板堿基互補，從而將有某種點突變的模板與正常模板區分開來(US專利No.5595890(1997))；

(6)KASP法(等位基因特異性PCR)，該方法由英國LGC公司開發，涉及兩個通用熒光探針，兩個通用淬滅探針，通用熒光探針與通用淬滅探針形成雙鏈的結構；通用反向引物；以及連接尾部序列的等位基因特異性正向引物；所述等位基因特異性引物所連接的尾部序列與通用熒光探針的序列互補；以及