[發明專利]一種獲得適合高密度種植和機械化收獲的油菜材料的方法

在審

• 申請號: 201710025164.3
• 申請日: 2017-01-13
• 公開（公告）號: CN106834340A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發明（設計）人: 譚小力;付正莉;黃琪;朱克明;王政;丁麗娜;曹軍;張志燕;陳克平
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12Q1/68;A01H5/00
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技術領域

本發明涉及一種獲得高密度種植和機械化收獲的油菜材料的方法，屬于植物基因工程和生物技術領域。

背景技術

油菜(Brassica napus) 屬于十字花科，是我國第五大農作物僅次于水稻、小麥、玉米和大豆。我國是植物油消費大國，國內菜籽油產量僅能滿足人們消費需求的2/3，大量油料消耗依賴進口。另外油菜作為生物柴油原料作物，被越來越多的國家所重視，有望成為解決化石能源危機的重要替代物,因此提高油菜的產量對我國具有重要的戰略性意義。

近年來我國社會發展迅速，鄉村勞動力減少，勞動力價格上漲，種植油菜的成本提高，種植面積日益減少。另一方面，我國油菜生產方式傳統，機械化水平遠不如小麥、水稻和玉米等作物，需要大量勞動力，從而導致我國油菜生產效率低，國際競爭力較弱。因此，進一步增強油菜生產的機械化水平，降低生產成本，提高農民種植積極性，是我國需要解決的首要問題。從育種角度出發，培育優良的適合高密種植及機械化收獲的油菜品種，根本解決油菜收獲機械化問題，成為育種家首要目標之一。

油菜分枝在植株生長過程中不僅在植株地上形態形成中起著重要作用，而且可通過影響單株結實量進一步影響到油菜總產量，因此在油菜生產中具有舉足輕重的地位。我國油菜品種主要特征有分枝較多、莖桿粗壯、株型較大、角果分散且易裂，導致機械收割困難大效率低，另外單株角果成熟時期不同，各部位角果之間成熟期差異較大，未成熟角果脫粒難而導致油菜收獲損失率高達10%~15%，迫切需要選育優良的油菜品種來提高油菜收獲得機械化水平。

發現并培育株型緊湊、分枝高度增高、花期集中、結莢層集中等新型油菜品種以適應密植及機械化收獲是國內外油菜品種改良的發展趨勢。

傅廷棟等（申請號CN200810048092.5）發明公開了一種適應高密度種植和機械化收獲得新型矮稈緊湊型油菜選育及鑒定方法，該方法通過不同油菜品種雜交得到的F1代植株，將F1代植株花蕾用秋水仙堿加倍染色體，小孢子培養獲得雙單倍體分離群體。然后對分離群體進行多年田間觀察、表型篩選得到該適合機械化收獲的矮稈緊湊型油菜品種。該方法屬于植物育種領域，獲得油菜品種時間漫長、工作量大、表型差異不明顯。

目前，本發明獲得一種初級分枝高度增高、分枝集中于頂部、結莢層集中的突變體植株，暫定名為sfz（少分枝）。

發明內容

本發明為克服現有技術中存在的技術缺陷，目的在于提供一種適合于油菜高密度種植和機械化收獲材料的獲得方法。利用該方法獲得的適應高密度種植、機械化收獲的油菜品種可有效解決當前油菜生產中面臨的收獲損失率高、種植成本高的問題。

本發明還公開了含有4個重復串聯CaMV 35S 增強子序列的激活標簽載體PCB260（關艷龍等，激活標簽法構建擬南芥突變體庫及其表型分析，云南植物研究，2010）在轉化獲得油菜突變體株中的應用。

本發明所述的一種適于高密度種植和機械化收獲的油菜材料的獲得方法，具體操作如下：

（1）采用農桿菌浸花法將激活標簽載體轉化到油菜中：

將激活標簽載體轉化到農桿菌感受態細胞中，將鑒定轉化成功的菌制備菌懸液；將目標物油菜植株上已開花的花蕾和角果減掉，然后進行浸花過程。

其中所述的激活標簽載體為pCB260；

所述的農桿菌感受態細胞為GV3101；

所述浸花過程如下：

（1）第一次浸花：除去開放的花蕾，把整個未開放花蕾浸潤于含有重組質粒pCB260的農桿菌菌液里5分鐘，浸花中輕柔地晃動菌液，利于提高轉化率；浸潤完畢的花蕾套入羊皮袋內。

（2）第二次浸花：距離第一次浸花后1-2天，重復步驟（1），此步無需去除開放的花蕾。

（3）第三次浸花：距離第二次浸花后1-2天，重復步驟（2）。

（4）浸花后管理：浸花結束后，待植株授粉完畢，去掉羊皮紙袋，不定時剪掉新生出的側枝花序以及經過浸花的花序其頂端新萌發的花蕾，直接用水澆灌培養植株，直至收獲。

注：每次浸花前都要按上述方法重新搖含有pCB260質粒的農桿菌菌液，保證菌液OD值為2，新鮮菌液生長活力強有利于提高轉化效率。

（2）利用綠色熒光蛋白GFP篩選油菜轉化株：

（3）采用草丁膦除草劑篩劑篩選油菜轉化株；

（4）PCR方法鑒定轉化植株：

將篩選得到的含有激活標簽載體pCB260的油菜突變體植株葉片作為實驗材料，CTAB法小量提取基因組DNA，PCR擴增激活標簽載體PCB260上的bar片段。