[發明專利]嗜熱菌株合成長鏈二元酸的應用方法

在審

• 申請號: 201710023896.9
• 申請日: 2017-01-13
• 公開（公告）號: CN107058412A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發明（設計）人: 李平;楊歆睿;肖林林;馮駿晨
• 申請（專利權）人: 同濟大學
• 主分類號: C12P7/64
• 分類號: C12P7/64;C12R1/38
• 代理公司: 上海科律專利代理事務所(特殊普通合伙)31290
• 代理人: 葉鳳

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及兩株嗜熱菌株合成長鏈二元酸的方法與應用。

背景技術

長鏈二元酸是一種含有10個及以上碳原子的脂肪族二羧酸(簡稱DCn)，作為化工中重要的中間原料，用于合成麝香、共聚酰胺熱溶膠、尼龍工程塑料、高溫電介質、耐寒增塑劑、高級潤滑油、高級油漆和涂料等精細化工產品，被廣泛應用于化工、輕工、農藥、醫藥、液晶材料等領域。由于長鏈二元酸在自然界中并不單獨存在，所以長鏈二元酸的合成一直是國內外學者的研究熱點。

長鏈二元酸主要合成方法為化學法和生物法。化學法的條件苛刻，成本高，環境污染嚴重，限制了其商業發展。生物法工藝以來源豐富的石蠟或脂肪酸為原料，經由微生物發酵得到長鏈二元酸，條件溫和，過程環保，是綠色長鏈二元酸，多種優勢的存在使生物法替代化學法成為必然趨勢。由于在夏季或者高溫地區，難以將發酵溫度維持在30℃左右。因此，選育出能夠在高溫條件下保持其產酸能力的菌株就有著十分重要的意義。

目前未見有報道關于嗜熱微生物合成長鏈二元酸的方法與應用方面的研究。

發明內容

本發明目的在于提供嗜熱微生物合成制備長鏈二元酸的方法。

1本發明提出嗜熱菌株合成長鏈二元酸的應用方法，包括嗜熱微生物篩選、分離及鑒定的方法以及嗜熱微生物合成制備長鏈二元酸的方法，

具體步驟如下：

(1)采集的土壤樣本則直接采用稀釋涂布法在正十二烷選擇培養基上進行涂布，于30℃、37℃和45℃水浴中培養3～5天。根據菌落的形態選擇有差別的單菌落接種到對應的液體培養基中，同樣溫度下水浴搖床培養3～5天。

(2)選擇能夠在正十二烷選擇培養基，即以烷烴作為唯一碳源的培養基上能夠生長的菌株，在含有甲基紅指示劑的指示培養基上進行劃線培養。

(3)同時，挑取選擇培養基上能夠生長的單菌落，接種于不添加甲基紅指示劑的50mL指示培養基中，分別在30℃、37℃、45℃條件下進行搖瓶培養，并在培養的第一天起，每天取出1mL培養液，并滴加1～2滴甲基紅指示劑，記錄培養4天培養過程中的顏色變化情況。

(4)挑選滴入指示劑后發生顏色變化明顯的菌株，進行后續發酵、生理生化及分子鑒定實驗，最終確定兩株菌株分別為食樹脂假單胞菌及類產堿假單胞菌。

(5)將篩選出的產酸菌株接入50mL種子培養基中，分別在30℃、37℃、45℃下培養48h。

(6)36h擴大培養過后，加入15％已滅菌的正十二烷，進入產酸期。產酸期持續4天，每隔12h或24h調整pH為7.5。

(7)取經離心、過濾后的發酵清液30mL，分別將15mL加入到2支15mL離心管中，并通過滴定法和分光光度法兩種方法進行十二烷二元酸濃度的檢測。

本發明優點在于

1.本發明實現了篩選出兩株能夠在高溫條件下，利用烷烴類碳源合成長鏈二元酸的新菌株(一般發酵溫度維持在30℃)。

2.本發明篩選出的高溫環境中生長的嗜熱微生物在菌體酶活性、對環境的適應性等方面較正常菌株具有突出優勢，解決了發酵法生產長鏈二元酸在高溫環境下的難以進行的難題。

3.本發明的工藝簡單，經由微生物發酵得到長鏈二元酸，條件溫和，過程環保，是綠色長鏈二元酸，適合于大規模工業生產。

4.本發明制備的長鏈二元酸在國內生產起步較晚，以它為原材料合成的下游高檔精細化工類產品目前主要以進口為主。長鏈二元酸是不可替代的原料，在國內為節約能源、使生產能夠全年連續進行創造更多經濟效益。

附圖說明

圖1 30℃下液體搖瓶培養取樣滴加甲基紅指示劑結果

圖2 37℃下液體搖瓶培養取樣滴加甲基紅指示劑結果

圖3 45℃下液體搖瓶培養取樣滴加甲基紅指示劑結果

圖4 2號、6號菌株16S rDNA電泳結果

圖5篩選出的2號、6號菌株生長曲線測定結果

圖6十二烷二元酸濃度標準曲線

具體實施方式

下面通過實施例進一步描述本發明。

實施例1：

(1)采集的土壤樣本則直接采用稀釋涂布法在正十二烷選擇培養基上進行涂布，于30℃水浴中培養3～5天。根據菌落的形態選擇有差別的單菌落接種到對應的液體培養基中，同樣溫度下水浴搖床培養3～5天。

(2)選擇能夠在正十二烷選擇培養基即以烷烴作為唯一碳源的培養基上能夠生長的菌株，在含有甲基紅指示劑的指示培養基上進行劃線培養。