[發明專利]一種表達多肽PA1B的方法

有效

• 申請號: 201710023844.1
• 申請日: 2017-01-13
• 公開（公告）號: CN106636205B
• 公開（公告）日: 2020-06-09
• 發明（設計）人: 王元濤;周廣燦
• 申請（專利權）人: 王元濤;周廣燦
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C07K14/415;C07K1/22;A61K38/16;A61P3/10;A23L33/185
• 代理公司: 常州佰業騰飛專利代理事務所(普通合伙) 32231
• 代理人: 張榮

本發明提供了一種高效表達多肽PA1b的方法，包括如下步驟：(1)目的基因PA1b的合成；(2)PA1b基因和載體的連接；(3)重組質粒PUSCN1?PA1b的轉化；(4)重組質粒的酶切、測序鑒定；(5)293F(人胚腎懸浮細胞)細胞的轉染；本發明的主要發明要點在于首次采用人源哺乳動物細胞成功表達PA1b，表達的蛋白質量穩定，產品均一，純度達到98％，并且本發明多肽PA1b蛋白能夠應用于制造治療糖尿病的藥物和食品中，其制作成本比胰島素低，并且比胰島素方便，可發展為口服型，無毒副作用，在血糖水平低于生理水平是不發揮降血糖作用。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種表達多肽PA1B的方法以及由上述方法制備的多肽PA1B在治療糖尿病中的應用。

背景技術

豌豆白蛋白1b(pea albumin lb，PAlb)為含37個氨基酸的單鏈肽，分子量為3，742Da，第3,7,15,20,22和32位的氨基酸均為半胱氨酸，由3對二硫鍵構成胱氨酸結模體。該肽在植物體內參與生長和代謝的調節，其作用模式與動物體內胰島素和胰島素樣生長因子作用類似。它在大豆種子中可結合7S Bg蛋白，7S Bg蛋白又可以結合動物胰島素和胰島素樣生長因子，故PA1b又名為豆類胰島素Leginsulin。

糖尿病是一種以高血糖為典型特征的代謝綜合征。據WH02016年報告，全球糖尿病患者己達到4.22億，中國糖尿病人己達到1.3億，占人口總數的9.4。據WHO估計，2005-2015年，中國用于糖尿病及相關心血管疾病導致的經濟損失達5577億美元。雖然糖尿病的治療與預防己得到全球高度重視，但是近年的多項調查表明，無論是歐美發達國家還是發展中國家，糖尿病控制狀況均不容樂觀。

目前糖尿病的治療藥物主要集中在胰島素、磺脲類藥物、GLP-1受體激動劑、DDP-W抑制劑、二甲雙胍類、噻唑烷二酮類等。遺憾的是這些藥物都存在比較明顯的缺點，如二甲雙胍類易導致乳酸血癥，噻唑烷二酮類存在肝毒性以及骨質丟失等副作用，磺脲類藥物長期服用易引起低血糖，而長期服用DDP-W抑制劑容易產生咳嗽，胰島素則具有不能口服、使用不方便等先天缺陷。

近來，NMR研究顯示，豆類胰島素與胰島素，Bg蛋白與胰島素受體在空間結構上有相似之處。那么PA1b是否具有胰島素樣調節糖代謝功能？引起了研究者的興趣。特別的是，這個植物多肽同時在動物胃腸道內被發現存在，它是否是新的類似腸促胰島素多肽激素，同樣也是令眾多研究者感興趣的問題。CN105944103A發現將具有降糖功能的大豆活性肽PAlb與其他降糖和/或降脂成分復配后不僅大大提高了降糖效果，減少用藥劑量，而且復配藥物具有保護胰島細胞的功能；豆類胰島素(PAlb)基因克隆、表達及融合蛋白純化，《華中科技大學碩士學位論文》，杜雯，2005，第一次用基因重組法制備PA1b，為深入研究PAIb的功能，開發“胰島素型”口服降糖藥物提供了基礎。

但現有的PA1b蛋白表達的方法還存在缺陷，其表達效率低下，純度不高，質量不穩定，因此，開發高效穩定表達大豆活性肽PA1b的方法成為研究的熱點。

發明內容

本發明的目的是提供一種表達多肽PA1B的方法，以解決現有技術所存在的表達效率低下的問題，本發明的方法具有表達穩定性好、安全性高、成本低以及易大規模生產；另外，由本方法制備的多肽PA1B在應用于治療糖尿病中取得了良好的效果。

為解決上述問題，本發明采用的技術方案為：

一種表達多肽PA1B的方法，包括如下步驟：

(1)目的基因PA1b的合成：查找PA1b基因序列，設計上下游引物；并以豌豆cDNA文庫為模板，以上游引物、下游引物進行PCR擴增獲得PA1b目的基因片段；