[發明專利]一種表達多肽PA1B的方法

有效

• 申請號: 201710023844.1
• 申請日: 2017-01-13
• 公開（公告）號: CN106636205B
• 公開（公告）日: 2020-06-09
• 發明（設計）人: 王元濤;周廣燦
• 申請（專利權）人: 王元濤;周廣燦
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C07K14/415;C07K1/22;A61K38/16;A61P3/10;A23L33/185
• 代理公司: 常州佰業騰飛專利代理事務所(普通合伙) 32231
• 代理人: 張榮

1.一種表達多肽PA1b的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)目的基因PA1b的合成：查找PA1b基因序列，設計上下游引物；并以豌豆cDNA文庫為模板，以上游引物、下游引物進行PCR擴增獲得PA1b目的基因片段；(2)PA1b基因和載體的連接：將目的基因片段PA1b和載體PUSCN1分別用限制性內切酶BamHI和XhoI酶進行雙酶切，然后通過T4連接酶將酶切后的基因片段PA1b和載體PUSCN1進行連接獲得重組質粒PUSCN1-PA1b；

(3)重組質粒PUSCN1-PA1b的轉化：將步驟(2)獲得的重組質粒PUSCN1-PA1b采用熱激轉化的方式導入到大腸桿菌DH5α感受態細胞中進行培養，之后提取重組質粒PUSCN1-PA1b；

(4)重組質粒的酶切、測序鑒定：將提取的重組質粒用BamHI和XhoI酶切，37℃酶切過夜，用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果；酶切結果正確，將質粒送往測序機構進行鑒定以確定已連接的片段為所需的目的片段；

(5)人胚腎293F懸浮細胞的轉染：在步驟(4)的鑒定結果通過后，將所述重組質粒PUSCN1-PA1b導入到人胚腎293F懸浮細胞進行轉染，轉染結束后，細胞繼續培養7天，之后6000RPM離心10min并收取上清，鎳離子柱親和純化PA1b蛋白，其純度達到98％，經鑒定即為多肽PA1b；

其中，所述PUSCN1載體增加了WPRE元件；其次，PA1b的N端增加了人的IL2的信號肽；PUSCN1載體的結構如附圖2所示。

2.根據權利要求1所述表達多肽PA1b的方法，其特征在于：所述上游引物為5-CGCGGATCCGCAAGCTGC-3，其酶切位點為BamHI；下游引物為5-CCGCTCGAGTTCCAGATGGATG-3，其酶切位點為XhoI。

3.根據權利要求1所述表達多肽PA1b的方法，其特征在于：所述PCR擴增的條件為：

95℃5min預變性，94℃30s、54℃30s、72℃50s，40個循環，72℃延伸10min。

4.根據權利要求1所述表達多肽PA1b的方法，其特征在于：所述步驟(5)中轉染前細胞密度調為2.5×10⁶/mL。

5.根據權利要求1所述表達多肽PA1b的方法，其特征在于：所述轉染是在如下條件下進行：細胞：質粒：PEI的比例＝1:3:9，轉染的時間為7天。

6.根據權利要求1所述表達多肽PA1b的方法，其特征在于：所述步驟(5)中蛋白的鑒定過程為：將蛋白濕轉入PVDF膜，然后孵育一抗，封閉之后再孵育二抗，利用ECL Reagent與二抗上的辣根過氧化物酶反應，產生發射波長為428nm的光波，此光經X光片感光記錄下來，結果顯示表達蛋白是多肽PA1b。