[發明專利]一種黑曲霉的復合誘變方法

在審

• 申請號: 201710022793.0
• 申請日: 2017-01-12
• 公開（公告）號: CN106701736A
• 公開（公告）日: 2017-05-24
• 發明（設計）人: 彭艷紅;胡志杰;蔣小東;孫福新;金賽;邵玉芬;李江華;劉龍
• 申請（專利權）人: 江蘇國信協聯能源有限公司
• 主分類號: C12N15/01
• 分類號: C12N15/01;C12N13/00;C12R1/685
• 代理公司: 無錫華源專利商標事務所(普通合伙)32228
• 代理人: 聶啟新

技術領域

本發明涉及微生物菌種的誘變選育技術領域，尤其是涉及一種一種原生質體與常壓室溫等離子體誘變復合選育黑曲霉檸檬酸高產菌株的方法。

背景技術

檸檬酸具有廣闊的應用前景和市場需求。出于經濟層面考慮，一部分研究在現有菌種的基礎上利用價格更低廉的粗糖原料以及農業廢渣來生產檸檬酸，而另一部分研究則致力于改良菌種。生產菌種的改造和選育是檸檬酸發酵工業的基礎，決定了發酵過程的成敗和發酵產品工業化生產的價值。我國是檸檬酸生產大國，雖然檸檬酸轉化率已經接近理論水平，產量可以達到170g/L，但發酵周期偏長，工業生產發酵周期普遍為72h，工業發酵水平還有待提高。

目前，國內的黑曲霉生產菌株均由誘變育種獲得，常用的誘變方法為化學誘變(硫酸二乙酯、亞硝基胍和氯化鋰等)和物理誘變(紫外、⁶⁰Co等)?；瘜W誘變劑主要通過與堿基結合形成加合物以及造成DNA烷基化引入變異，紫外則通過使DNA分子形成環丁烷嘧啶二聚體阻礙堿基間的正常配對造成核酸變異。這些誘變操作存在安全性風險，此外誘變效率可控性有限。常壓室溫等離子體誘變是最近發展起來的技術，電子在射頻電場作用下獲得能量，通過碰撞，與周圍中性粒子發生能量交換，使其分解、激發或電離，在兩級電壓作用下，氣體被擊穿產生放電，形成具有一定電離度的等離子體。通過高濃度的中性活性粒子會造成細胞的亞致死效應，使核酸出現開環、斷裂、破碎現像，再利用細胞自身的DNA修復機制，實現胞內遺傳物質的變化。此外，等離子體產生的活性氧成分(reactive oxygenspecies，ROS)由于細胞膜通透性增強而進入細胞，也進一步造成DNA損傷。因此等離子誘變可以同時造成基因突變和染色體變異,有望獲得高產黑曲霉檸檬酸生產菌株。

發明內容

針對現有技術存在的上述問題，本申請人提供了一種黑曲霉的復合誘變方法。本發明方法使用設備簡單、操作方便、誘變效率高。

本發明的技術方案如下：

一種黑曲霉的復合誘變方法，所述方法為在黑曲霉原生質體上進行常壓室溫等離子體誘變，具體包括如下步驟：

(1)孢子預培養；(2)菌體酶解脫壁；(3)常壓室溫等離子體誘變；(4)原生質體再生培養；(5)24孔板篩選；(6)搖瓶發酵復篩。

所述步驟(1)中孢子預培養的方法為：從活化培養好的斜面收集孢子(將-80℃凍存的黑曲霉甘油管種轉接到斜面培養基進行活化培養，34-37℃培養6天，活化2次)，并以10⁶個/mL的接種量接種到裝有50mL培養基的250mL三角瓶中，30℃，200rpm培養16h，然后收集菌球。

所述斜面培養基配方：麥芽提取物30g/L，胰蛋白胨5g/L，瓊脂1.5％，121℃滅菌15min。

所述步驟(2)的具體方法為：將菌球用KMC液洗滌2～3次后過濾，然后加入50mL溶壁酶和幾丁質酶溶液，混勻，置于37℃水浴保溫處理2h后，4℃2000g離心10min，棄上清液，用KMC液洗滌2次除去細胞壁酶解液，將原生質體懸浮于100μL KMC液中備用。

所述KMC液：0.7M KCl，50mM CaCl₂，20mM Mes/NaOH，pH 5.8，121℃滅菌15min，4℃保存備用；

所述細胞壁酶解液：5mg/mL溶壁酶、0.2U/mL幾丁質酶，0.22μM無菌過濾器除菌。

所述步驟(3)的具體方法為：將原生質體懸液吸取10μL置于載片上，常壓室溫等離子體誘變處理120s，工作條件為：氣體流量10slm，照射功率100W。

所述步驟(4)的具體方法為：將原生質體用KMC液系列梯度10-10⁵倍，吸取100μL原生質體稀釋液于再生固體培養基中進行再生培養，培養條件35℃培養36h。

所述原生質體再生培養基配方：麥芽提取物30g/L，胰蛋白胨5g/L，1.2M山梨醇，1％的瓊脂，121℃滅菌15min。

所述步驟(5)中24孔板篩選的方法為：將在原生質體再生培養基上生長起來的單菌落待長出濃密孢子，用24孔板進行初篩；具體步驟包括：

①種子培養：每個孔裝3mL種子培養基，接種1個菌株，35℃，180rpm培養24h；所述種子培養基為玉米清液和混液按比例混合，總糖含量10％，總氮含量0.2％；