[發明專利]一種黑曲霉的復合誘變方法

在審

• 申請號: 201710022793.0
• 申請日: 2017-01-12
• 公開（公告）號: CN106701736A
• 公開（公告）日: 2017-05-24
• 發明（設計）人: 彭艷紅;胡志杰;蔣小東;孫福新;金賽;邵玉芬;李江華;劉龍
• 申請（專利權）人: 江蘇國信協聯能源有限公司
• 主分類號: C12N15/01
• 分類號: C12N15/01;C12N13/00;C12R1/685
• 代理公司: 無錫華源專利商標事務所(普通合伙)32228
• 代理人: 聶啟新

1.一種黑曲霉的復合誘變方法，其特征在于所述方法為在黑曲霉原生質體上進行常壓室溫等離子體誘變，具體包括如下步驟：

(1)孢子預培養；(2)菌體酶解脫壁；(3)常壓室溫等離子體誘變；(4)原生質體再生培養；(5)24孔板篩選；(6)搖瓶發酵復篩。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(1)中孢子預培養的方法為：從活化培養好的斜面收集孢子，并以10⁶個/mL的接種量接種到裝有50mL培養基的250mL三角瓶中，30℃，200rpm培養16h，然后收集菌球。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(2)的具體方法為：將菌球用KMC液洗滌2～3次后過濾，然后加入50mL溶壁酶和幾丁質酶溶液，混勻，置于37℃水浴保溫處理2h后，4℃2000g離心10min，棄上清液，用KMC液洗滌2次除去細胞壁酶解液，將原生質體懸浮于100μL KMC液中備用。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(3)的具體方法為：將原生質體懸液吸取10μL置于載片上，常壓室溫等離子體誘變處理120s，工作條件為：氣體流量10slm，照射功率100W。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(4)的具體方法為：將原生質體用KMC液系列梯度10-10⁵倍，吸取100μL原生質體稀釋液于再生固體培養基中進行再生培養，培養條件35℃培養36h。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(5)中24孔板篩選的方法為：將在原生質體再生培養基上生長起來的單菌落待長出濃密孢子，用24孔板進行初篩。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法還包括步驟(7)傳代穩定性檢測，即：將孢子制備含15％甘油的凍存管，凍存于-80℃，活化培養并以此為第一代；從第一代斜面種刮取孢子液，稀釋后涂布于固體培養基35℃培養24h至長出單菌落，將單菌落轉接到新的斜面培養，此為第二代；從第二代斜面刮取孢子液，稀釋后涂布于固體培養基35℃培養24h至長出單菌落，將單菌落轉接到新的斜面培養，此為第三代；以此類推，傳至第20代，將20代菌株進行搖瓶發酵試驗，并檢測發酵液檸檬酸產率。