[發明專利]一種大鯢皮膚表皮細胞的分離、培養及鑒定方法

有效

• 申請號: 201710022400.6
• 申請日: 2017-01-12
• 公開（公告）號: CN106754647B
• 公開（公告）日: 2018-08-28
• 發明（設計）人: 郭燕杰;楊學義;馬西亞;吳衛妮;張延召;史明艷;張瑞潔
• 申請（專利權）人: 洛陽師范學院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12Q1/6869;C12Q1/6888
• 代理公司: 鄭州市華翔專利代理事務所(普通合伙) 41122
• 代理人: 王明朗

本發明公開了一種大鯢皮膚表皮細胞的分離、培養及鑒定方法，該方法是從大鯢尾部獲得皮膚組織，利用組織塊法分離獲得原代大鯢皮膚表皮細胞，在28℃及特定培養液(成分：DMEM/F12(60％)+15％FBS+5μg/mL胰島素+10ng/mL KGF)中進行原代和傳代培養，并利用RT?PCR對獲得的大鯢皮膚表皮細胞進行特異性基因(K5、K10和P63)表達鑒定。本發明利用相近物種基因序列的同源性設計引物來對大鯢K5、K10和P63基因進行PCR擴增，首次獲得大鯢K5、K10和P63基因序列。本發明提供的大鯢皮膚表皮細胞的分離、培養和鑒定的方法，為大鯢皮膚的深層次研究以及利用大鯢皮膚表皮細胞進行皮膚再生、創傷修復以及構建組織工程皮膚奠定了基礎。

技術領域

本發明屬于細胞、組織工程技術領域，具體涉及一種大鯢皮膚表皮細胞的分離、培養及鑒定方法。

背景技術

大鯢是世界上現存最大最珍貴的兩棲動物，是國家二類水生野生保護動物，也是農業產業化和特色農業重點開發品種，已在我國多地養殖并形成一定產量，2012年大鯢養殖量已經突破330萬尾。研究表明，人工養殖大鯢的皮膚中含有豐富的Ⅰ型膠原蛋白，約占大鯢皮膚中蛋白質總量的62.89％，該膠原蛋白具有與哺乳動物膠原相似的氨基酸組成和性質，對人體沒有排異性，同時具有嫩白、容顏、祛皺的美容功效。大鯢皮膚分泌的黏液含有多種“蛙皮素”，具有較強的抗菌作用，可作為新的抗生素藥物來源進行研究開發。大鯢還有超強的再生和自我修復能力，民間常以其皮膚研粉拌桐油治療火燙傷，促進皮膚再生。因此，大鯢皮膚及其分泌物的研究有著廣闊的應用前景。

但是對于大鯢皮膚及其分泌物的研究還存在以下瓶頸：(1)大鯢表皮細胞的培養基組成成分、細胞培養溫度等條件尚不明確，需要經過摸索，才能找到適合大鯢表皮細胞生長的培養條件。(2)大鯢表皮特異基因的序列目前還沒有，需要根據基因序列的同源性，比較不同已知物種的序列，在同源性高的區域設計多對PCR引物進行摸索，找到能夠擴增大鯢表皮特異基因的引物。因此目前關于大鯢皮膚表皮細胞的研究，特別是大鯢皮膚表皮細胞的分離、培養以及鑒定方法還未見報道。

發明內容

為了解決上述問題，本發明的目的是提供一種大鯢皮膚表皮細胞的分離、培養及鑒定方法，該方法實現了大鯢皮膚表皮細胞的人工培養，為大鯢皮膚的實驗研究提供了技術支持。

為了實現上述目的，本發明所采用的技術方案是：

一種大鯢皮膚表皮細胞的分離、培養及鑒定方法，包括以下步驟：

(1)取活體大鯢尾部的皮膚組織，放入PBS緩沖液中；

(2)在10min內，將放入PBS緩沖液的皮膚組織表面的粘液刮去，再放入75％酒精中浸泡10s；

(3)用PBS緩沖液清洗6-8次，將皮膚組織剪成直徑1mm的組織塊，將組織塊貼到T25培養瓶中，加入4mL培養液進行貼壁培養，每天更換新鮮培養液，皮膚組織塊貼壁培養6天后進行傳代培養，得到大鯢皮膚表皮細胞。

所述的PBS緩沖液為4℃預冷、體積分數60％的添加雙抗的PBS緩沖液，雙抗為青霉素和鏈霉素，其中，青霉素為500U/mL，鏈霉素為0.5mg/mL。

所述的培養液主要成分為DMEM/F12培養基，除DMEM/F12培養基外，還包括培養液總體積15％的胎牛血清以及在培養液中濃度為5μg/mL的胰島素、10ng/mL的KGF和雙抗，雙抗為青霉素和鏈霉素，其中，青霉素含量為100U/mL、鏈霉素含量為0.1mg/mL；所述的DMEM/F12培養基是體積分數60％的DMEM/F12培養基。

步驟(3)中的貼壁培養條件為28℃、5％CO₂。

所述的大鯢皮膚表皮細胞的分離、培養及鑒定方法，還包括大鯢特異表達基因K5、K10及P63基因的鑒定。

所述的大鯢特異表達基因K5、K10及P63基因的鑒定方法為：