[發明專利]腸道及口腔菌群多樣性及差異性的分析方法

有效

• 申請號: 201710019639.8
• 申請日: 2017-01-12
• 公開（公告）號: CN107058490B
• 公開（公告）日: 2018-03-06
• 發明（設計）人: 張磊;楊俊杰;孟曉飛
• 申請（專利權）人: 楊俊杰
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/04
• 代理公司: 北京瑞思知識產權代理事務所(普通合伙)11341
• 代理人: 李濤

技術領域

本發明涉及一種基于新一代高通量測序技術的疾病患者腸道及口腔微生物多樣性及差異性的檢測的技術和方法。

背景技術

人體大部分的生理功能是人本身與微生物群共同進化過種中形成的共生生活的結果，健康人體存在著多種正常的微生物群落，他們與宿主存在著共生關系，共同維護著宿主的生理平衡。一旦宿主與微生物之間共棲共生的穩態被打破，就會誘發多種人類疾病。目前已經認識到腸道和口腔微生物與人類健康和疾病的密切關系，因此，僅僅從人類自身角度出發來研究人類疾病遠遠不夠，必須考慮到與人類共棲共生的腸道微生物的作用。

傳統的研究微生物的方法主要依賴于分離培養技術，但是人體內可培養的細菌只占細菌總數很小一部分，大部分的微生物是難以培養的，故我們應用目前的分離培養技術很難深入了解人體菌群整體結構及其宿主之間的相互關系。隨著分子生物學的發展，使人們全面了解各生境內的菌群結構和功能成為可能。

隨著二代測序技術在疾病領域研究的發展，以微生物菌群為靶點的治療方案就是精準醫療非常重要的一個體現。它主要以每位患者的個體化數據為基礎，通過對病人身體相關微生物組如腸道，口腔，皮膚等進行大規模測序，生物信息學分析后并挖掘每位患者病理學、生理學和病理生理學等方面的特點，進一步制定出適合每位患者的獨特的、最佳的治療和預防方案，提高治療的針對性，從而取得最優的療效。

本發明以兒童自閉癥為例進行說明。兒童孤獨癥或稱自閉癥，是一種廣泛性發展障礙，以嚴重的、廣泛的社會相互影響和溝通技能的損害以及刻板的行為興趣和活動為特征的精神疾病。目前自閉癥患者已達6700萬人，中國的自閉癥患兒也已超過100萬人，且患病率逐年上升。自閉癥的主要病癥包括不正常的社交能力、溝通能力、興趣及行為模式，其病因尚不明確。有研究顯示，孤獨癥和腸道菌群失調有關。

發明內容

本發明的目的即在于提供一種針對疾病患者腸道及口腔菌群的多樣性及差異性的檢測方法。

本發明的再一個目的是提供一種通過設計特異性引物(人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個引物與目的基因一端的一條DNA模板鏈互補，另一個引物與目的基因另一端的另一條DNA模板鏈互補)，適用于多種類疾病患者腸道和口腔菌群的多樣性及差異性的檢測方法。

本發明的又一個目的在于為人們更好的了解腸道及口腔微生物以及與疾病之間的相互關系提供技術支撐和理論基礎。

1.在本發明中，所述引物對(上、下游引物統稱為一對引物)不限于由所述序列所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對，只要是能夠特異性擴增所有需要檢驗的微生物來源的引物對均可。

本發明提供了一種檢測疾病患者腸道菌群的多樣性及差異性的特異性引物對，其特征在于，所述引物對是能夠特異性擴增所有需要檢驗的微生物來源的引物對。

本發明提供了一種檢測疾病患者腸道菌群的多樣性及差異性的特異性引物對，其特征在于，所述引物對是能夠特異性擴增所有需要檢驗的微生物來源的引物對。所述引物對是由兩條單鏈DNA分子序列組成的引物對。所述引物對

上游引物為：

5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATGGTAATTGTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’；

下游引物為：

5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNNNNNAGTCAGTCAGCCGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’。

所述的引物對，用于生物技術及檢測領域，通過二代高通量測序技術，精準檢測疾病患者腸道菌群的多樣性及差異性。

2.本發明還提供一種判定待測疾病患者體內腸道菌群的多樣性及差異性的方法，其特征在于包括以下步驟，

(1)收集待測樣本并進行微生物基因組DNA提取，得到基因組DNA提取液；

(2)對基因組DNA提取液進行檢測確定樣本中微生物基因組DNA的濃度和純度；

(3)利用16SrDNA特異的V3-V4區引物對基因組DNA提取液進行PCR擴增，進行文庫構建；

(4)利用Illumina MiSeq測序系統進行測序；

(5)利用FLASH，QIIME，usearch61進行生物信息學分析

3.本發明所述糞便樣本的采集及糞便樣本DNA的提取方法為：

(1)所述糞便樣本的采集方法具體為：

1)將糞便排入一個清潔且干燥的容器內。注：容器內不能混入尿液。