[發明專利]一種制備人皮膚成纖維細胞膜片的細胞培養基和使用方法

在審

• 申請號: 201710018241.2
• 申請日: 2017-01-10
• 公開（公告）號: CN106635961A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發明（設計）人: 聶蘇秦
• 申請（專利權）人: 陜西九州生物醫藥科技集團有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 北京匯信合知識產權代理有限公司11335
• 代理人: 吳甘棠

技術領域

本發明涉及一種細胞培養基，具體涉及一種制備人皮膚成纖維細胞膜片的細胞培養基和使用方法，屬于生物技術領域。

背景技術

成纖維細胞是構成皮膚真皮層的主要細胞，是真皮層產生膠原蛋白、彈性纖維蛋白以及其他ECM(細胞外基質)的主要細胞，膠原蛋白和彈性蛋白在皮膚組織中的作用就是形成皮膚支架，保持皮膚彈性。吸納水分，使皮膚細膩、光滑、富有彈性。

所以成纖維細胞的正常增殖、分化維系著皮膚正常的結構和生理功能。隨著年齡的增長，皮膚真皮層厚度變薄，真皮層內的成纖維細胞數量減少，從而引發一系列的皮膚問題：皺紋、沒有彈性、松弛、干枯沒有光澤等。解決這些皮膚問題的根源就是補充皮膚真皮層內的成纖維細胞。

目前批準的唯一一款成纖維細胞產品LIVIV，是將皮膚成纖維細胞經過分離培養注射到皮膚真皮層內，為在成年中改善中度至嚴重鼻唇溝皺紋(微笑線)的外觀。細胞沒有支架，注射之后很容易流失，從而失去效果。

發明內容

本發明的目的在于，提供一種制備人皮膚成纖維細胞膜片的細胞培養基和使用方法，以克服現有技術所存在的上述缺點和不足。本發明是利用成纖維細胞在培養過程中自身分泌的富含膠原蛋白、彈性纖維蛋白的細胞外基質成分為天然支架成分，制備成成纖維細胞膜片，即保證了成纖維細胞的活性，又解決了單純成纖維細胞注射易流失的問題。

本發明所需要解決的技術問題，可以通過以下技術方案來實現：

作為本發明的第一方面，一種制備人皮膚成纖維細胞膜片的細胞培養基，其特征在于，包括：

(2)基礎培養基：H-DMEM或者DF12；

(2)添加組分：維生素C 50-100μg/ml，

表皮細胞生長因子(EGF)3-20ng/ml，

(3)血清5-15％。

還包括：(4)dispase II(麥約爾CEL078)；

(5)IV型膠原酶(GIBCO,17104-019)；

(6)0.25％胰蛋白酶；

(7)皮膚保存液。

其中，(1)基礎培養基為H-DMEM(High Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium)、或者DMEM-F12；

形式：干粉(純水、過濾)、液體；

提供狀態：無菌

配置方法：向基礎培養基粉末(例如H-DMEM)，加入無菌超純水一部分，進行先溶解，然后根據培養基說明書規定的體積進行定容；

充分溶解后，0.22微米濾膜進行過濾、封裝；

然后按照需求，在基礎培養液中加入5％-15％的血清。

如果是液體H-DMEM，直接在容器中加入5％-15％的血清，混勻即可。

pH調節：使用pH試紙(或者pH電位計)測試培養基pH值，如不符合規定，可用10％的HCl或10％NaOH調節，直到符合配方要求，一般在pH 7.0-7.5之間。

其中，(2)添加組分按照培養基的終體積，配置。

其中，(3)血清的種類選自動物血清、胎牛血清、人血清，最佳的自體血清(臨床使用)，血清的濃度5-15％；

提供狀態：無菌、補體滅活

自體血清的制備：

5)血清分離：將血樣進行分離；

6)過濾除菌：將步驟1)得到的樣品0.22微米過濾器進行兩次過濾；

7)血清滅活：將步驟2)得到的樣品56℃水浴滅活熱原至少30min，冰箱冷藏室保存待用；

8)紫外線照射：有時，在步驟3)獲得的樣品在使用或者封裝前要紫外線照射。

(4)dispase II(麥約爾CEL078)配制

用電子天平秤取1g的dispase II粉末，用33ml的0.9％生理鹽水完全溶解，攪拌均勻，在超凈工作臺用0.22微米過濾器進行過濾除菌；配制成1g/33ml(24U/ml)的母液；母液放置在-20℃凍存；使用時將母液稀釋至1.5-2.4U/ml的工作液。

(5)IV型膠原酶(GIBCO,17104-019)配制

用電子天平秤取1g的IV型膠原酶粉末，用100ml的0.9％生理鹽水完全溶解，攪拌均勻，在超凈工作臺用0.22微米過濾器進行過濾除菌；配制成1g/100ml(2100U/ml)的母液；母液放置在-20℃凍存；使用時將母液稀釋至30-50U/ml的工作液。

(6)0.25％胰蛋白酶配制